Clostridi psicrotolleranti e rigonfiamento di confezioni di carni refrigerate sottovuoto in imballaggi plastici

Carlo Cantoni. Libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale. Milano

Recentemente i sono registrati nuovi episodi di rigonfiamento di carni sottovuoto refrigerate come già avvenuto in anni precedenti. Si è quindi ritenuto utile fornire  informazioni su questa alterazione fornendo anche le più recenti  conoscenze ottenute dai ricercatori su questo argomento. Storicamente il rigonfiamento delle confezioni  contenenti carni refrigerate mantenute sottovuoto causata da clostridi psicrotolleranti  si manifestata per la prima volta nel 1989. Due gruppi di ricercatori,lavorando il primo negli Stati Uniti (Kalchayanand & coll.1989) e il secondo nel Regno Unito (Dainty & coll.1989) identificarono un Clostridium sp quale responsabile dell’alterazione. Le confezioni apparivano gonfie per la formazione di un gas “di odore disgustoso  con presenza contemporanea di liquido liberatosi dal tessuto muscolare”.la carne presentava un colore smorto e poca consistenza (Kalchayanand.1989).In tempi successivi fu identificato il microrganismo responsabile e venne denominato Clostridium estherteticum da Collins & coll nel 1992. I clostridi pscrofili e psicrotrofi (psicrotolleranti) sono stretti aerobi ed stato chiarito che il rigonfiamento è dovuto alla contaminazione della carne con endospore resistenti. Queste contaminano gli ambienti di lavorazione della carne provenendo dalle pelli e degli animali da macellare e  vengono,poi,trasferite alle carcasse durante le operazioni di disossamento. Il miglior metodo per controllare il rigonfiamento da clostridi psicrotolleranti  basato sull’applicazione delle più rigorose  modalità igieniche possibili.Infatti le spore sono molto resistenti al calore, alle radiazioni UV e ai disinfettanti.

Caratteristiche dell’alterazione

I clostridi responsabili del rigonfiamento maleodorante delle confezioni delle carni refrigerate identificati sono stati identificati come C.estherteticum, C.laramiense, C.gasigenes e C.frigidicarnis. Ultimamente Moschonas & coll., (2011,2013) hanno isolato un nuovo clostridio da pelle  di bovino, potenziale causa di rigonfiamento. Il ceppo, denominato TC1 provvisoriamente, è sottoposto ad analisi fenotipiche, chemotassonomiche e genotipiche, è risultato una nuova specie. Inoculato in campione di carne confezionata sottovuoto  ha provocato il  rigonfiamento (bombaggio) dell’alterazione dopo 42 giorni di incubazione. E’ un nuovo clostridio di  considerevole importanza economica per l’industria della carne bovina. Altri clostridi psicrotolleranti non produttori di gas ma anch’essi agenti di alterazione delle carni sono stati identificati,precisamente: C.algidicarnis, C.algidixylanolyticum. Tassonomincamente, l’inclusione di un microrganismo nel genere Clostridium è basata su quattro caratteristiche morfologiche: la capacità di formare endospore, un metabolismo strettamente anaerobico l’incapacità di ridurre il solfato e la Gram positività della cellula. Tra i numerosi ceppi di clostridi è presente un’ampia diversità. L’analisi del 16S rDNA ha rivelato l’esistenza di 19 o 20 clusters (gruppi) tra i clostridi. Le  specie alteranti i prodotti carnei refrigerati confezionati sottovuoto sono tutti psicrofili o psicrotrofi e fanno parte dei gruppi 1 e XIV, tranne il clostridio TC1 Che non rientra nei due gruppi (Broda &coll.2002: Moschonas & coll.2013). In questa relazione si adottano le seguenti definizioni: PSICROFILI, temperatura ottimale di crescita 15°C o meno; temperatura massima di crescita da15 a 20°C; temperatura minima di crescita da -5 a 5°C. PSICROTROFI: temperatura ottimale di crescita tra 25 °C e 30°C; temperatura massima di crescita tra 30°C e 35°C; temperatura minima di crescita da 4°C-5°C. PSICROTOLLERANTI:il termine comprende i ceppi capaci di svilupparsi alle temperature di refrigerazione a partire da -5°C.Quindi i ceppi di C.estherteticum (C.estherteticum subsp. esterteticum e C.esterteticum subsp laramiense) originariamente isolati da carni refrigerate sottovuoto sono veri psicrofili. Le due sub specie estherteticum e laramiense hanno una temperatura ottimale di crescita di 6-8°C e di 15°C rispettivamente (Collins 1992) Il gas prodotto dai due clostridi contiene idrogeno, anidride carbonica, butanolo e  ac. butanoico (butirrico) in elevate concentrazioni, esteri e composti solforati. Il secondo produttore di gas, il C.gasigenes è uno psicrotrofo con una temperatura ottimale di crescita tra 20 e 22° come C.algidicarnis, la cui temperatura ottimale di crescita è tra 25°C-30°C. Anche il quarto clostridio, il C.frigidicarnis si sviluppa a 30-38 °C rientrando anch’esso in questa categoria. Complessivamente i clostridi psicrotolleranti isolati da carni sono: C.algidicarnis, C.algidixilanolyticum, C.estherteticum, C.laramiense, C.frigidicarnis, C.gasigenes e Clostridium TC 1. Altri clostridi psicrotolleranti sono stati isolati da terreni, fanghi permafrost e da acque: C.algarophilum, C.bowmanii, C.lacusfryxellens e C.tagluense ( Spring & coll. 2003; Shcherbakova & coll. 2005; Sustin & coll.(2009).

Presenza di clostridi psicrotolleranti in carni refrigerate confezionate causa di rigonfiamenti (bombaggi)

I prodotti carnei presenti nelle confezioni rigonfie sono stati: tagli carnei di bovino, ovino, cervo, arrotolati carnei cotti per cani, tacchino precotto, roastbeef e vari prodotti carnei. Tutti alimenti contenuti in imballaggi di materiale plastico impermeabile all’ossigeno. Le confezioni rigonfie per presenza di C.estherteticum sono state riscontrate negli Stati Uniti, Nuova Zelanda, Irlanda, Sud Africa (Helps & coll.1999). C. estherteticun subsp lameriamiense è stato isolato nel Nord America (Kalchayanand & coll.1993). C.gasigenes è stato isolato in carni in Irlanda, Regno Unito e Nuova Zelanda (Cavill & coll.2011). C.frigidicarnis e C.algidixilanolyticus sono risultati responsabili di alterazione di carni confezionate sottovuoto  preparate in Nuova Zelanda (Yang & coll.2009). C.algidicarnis è stato isolato da carni suine cotte nel Nord Europa (Lawson & coll.1994) e da carni refrigerate in Nuova Zelanda  sopratutto cosce e lonze suine (Boerema & coll.2002). Le carni ovine sono risultate più contaminate rispetto a quelle bovine (Amin & coll. 2011). In Italia, nonostante i numerosi casi registrati non è stato possibile isolare i clostridi responsabili per errori  dovute alle tecniche d’indagini adottate.

Condizioni che permettono a crescita dei clostridi psicrotolleranti nelle carni confezionate sotto vuoto

Oltre a C.estherteticum e C.laramiense anche C.algoriphilum, C.bowmanii, C.frigoris, C. frigidicarnis, C.lacusfryxellense, C.psycrophilum, C.tagluense e C.vincenti sono in grado di crescere nel substrato carneo metabolizzando il glicogeno,il glucosio formatisi nel tessuto muscolare dopo la morte dell’animale. Quando il loro contenuto diminuisce quasi completamente, C. frigidicarnis utilizza per la crescita gli aminoacidi, mentre C.algidixylanolyticum e C.frigidicarnis utilizzano glicogeno, glucosio e lattato contemporaneamente durante la loro crescita e dopo  quando cessa. C.algoriphilum e C.frigoris cominciano ad utilizzare il lattato, utilizzando poi glicogeno e glucosio solo dopo il termine della loro fase di crescita, sebbene l’utilizzazione del lattato da parte di C. algoriphilum sia lieve. C.psychrophilum interrompe l’utilizzazione del glicogeno e del glucosio ma inizia una  lieve utilizzazione del lattato al termine della sua crescita. Le altre specie restanti C..esterthticum, C.bowmanii, C.gasigenes, C.tagluense e C.vincentii non utilizzano più alcun substrato dopo il termine del loro sviluppo. L’utilizzazione del glicogeno, glucosio e di quantità relativamente elevate di lattato  cessata la loro moltiplicazione da parte di C.algidixylanoliticum, C.frigoris e  C.frigidicarnis indica che questi microrganismi sono una causa potenziale, anch’essi di rigonfiamento delle carni refrigerate confezionate (BPS =blown pack spoilage) mentre tutti i restanti clostridi psicrotolleranti conosciuti non svolgono alcun ruolo in proposito (Yang & Badoni 2013).

Attuali possibilità di prevenzione del rigonfiamento delle confezioni di carni refrigerate sottovuoto.

Ricerche eseguite in Irlanda e  Nuova Zelanda in mattatoi hanno constatato che la contaminazione dei locali di lavorazione della carne deriva dalle pelli degli animali e che i clostridi sono pure presenti nelle feci  degli animali. Da queste fonti i clostridi vengono  a contatto con le carcasse durante le fasi di macellazione e di disossamento delle carcasse .C.estherteticum e C. gasigenes sono stati isolati dal suolo, dalle pelli grezze e dalle feci, ma non nei locali di sezionamento  e solo in limitate concentrazioni sui pavimenti contaminati dai calle calzature del personale  (np) (Moschonas & coll.2009). Al momento la  principale strategia da adottare in proposito è  basata sull’ applicazione delle GMP ( Good Manufacturing Practice) durante le fasi di lavorazione, prestando cura particolare nella fase di scuoiamento, evitando il passaggio di personale da questa zona al resto dei locali di lavorazione. Per la sanificazione degli ambienti e superfici  si deve obbligatoriamente ricorrere all’uso di disinfettante a base di acido perossiacetico. Altre strategie di intervento che hanno fornito qualche risultato, comunque con conclusivo, sono state l’aspersione di acido lattico sulle superfici delle carcasse, il loro lavaggio con acqua calda o  il trattamento con vapore. Tuttavia questi due ultimi trattamenti potrebbero riuscire controproducenti perché potrebbero far germinare le spore.

Tecniche per l’isolamento e l’identificazione dei clostridi psicrotolleranti

Le modalità di isolamento e di identificazione dei clostridi psicrotolleranti con i metodi tradizionali di batteriologia sono operazioni complesse richiedenti molto tempo per consentire la crescita dei clostridi (da 14 a 38-40 giorni) con l’incubazione delle colonie in stretta anaerobiosi  a 10°C di temperatura. Per il loro isolamento è necessario adottare il metodo di Lund & coll. (1990) che prevede  la sospensione del campione o dell’essudato in brodo preridotto (riscaldandolo) in terreno PYGS brodo e strisciandolo su Columbia Blood agar (CPA)addizionato del 5% di sangue di cavallo o di sangue di pecora (Boerema & coll.2003,  Moschonas & coll.2013). I campioni in esame alternativamente, possono essere trattati con ertanolo per eliminare i contaminanti salvaguardando le spore I ceppi isolati devono essere insemenzati in Reinforced Clostridium medium in stretta anaerobiosi. Per la successiva identificazione dei ceppi cresciuti si deve ricorrere all’esame del 16SrRNA. Un  metodo più rapido, ma solamente indicativo prevede la determinazione dei composto volatili del gas mediante GC/massa I composti di riferimento per C.estertheticum sono l’ac. butanoico (acido butirrico), l’a.butanolo, il 2-metil-etil-estere dell’ac. butanoico e il 3 metil butanolo-3.metil butanale.Possono essere presenti in tracce etanolo, 1-esaolo.1.propanolo(alcoli) Benzaldeide, eptanale, esanale (aldeidi). Cicloottano, etilbenzene,xilene (idrocarburi).2-butanone,-3-butanone.propanone.acido acetico. Dimetil solfuro, dimetil disolfuro, di metil trisolfuro (composti solforati)

Tabella riassuntiva di alcune caratteristiche di clostridi psycrotolleranti

Ceppo	Fonte	Temperatura ottimale di crescita (°C)	Intervallo crescita	PH	Tipo di alterazione
C algidicarnis	Carne sottovuoto	25-30	4-37	-	Alterazione superficiale
C.algidixylanoliticum	Carne sottovuoto ovino
C.estherteticum subsp estherteticum	Carne sottovuoto	6-8	1-15	6,5-7,2	Blown pack
C.estheteticum subsp. lameramiense	Carne bovina fresca roastbeef	Idem	Ideam	Idem	idem
C.frigidicarnis	Carne bovina	30-38,5	3,8-40,5	6,4-7,2	Alterazione superficiale
C.gasigenes	Carne ovina refrigerata	20-22	-1,5 – 26	6,2-8,6	Blown pack

                                       

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