Carlo Cantoni, libero docente in Ispezione degli alimenti di origine
animale, Milano
Il genere
Listeria comprende batteri catalasi positivi, asporigeni, privi di capsula,
anaerobi facoltativi, Gram positivi. Nel genere sono presenti specie patogene e
non patogene. Tra le specie patogene esistono cloni virulenti e poco virulenti
e non patogeni. A tutt’oggi sono state identificate 18 specie e 6 sottospecie.
Oltre alle specie già note come L.monocytogenes, L.innocua, L.seeligeri, L.welshimeri,
L.grayi e L.ivanovii (subsp.ivanovii e subsp.londonensis), L.marthii e L.rocourti,
sono state isolate e tipizzate L.acquatica, L.boeriae, L.cornellensis. L.fleischmanii,
L.fleischmanii subsp.coloradonensis, L.fleischmanii subsp.fleischmanii, Lfloridensis,
L.grandenensis, L. newyorkensis, L.riparia, L.weihenstephanensis, L.monocytogenes
e L.ivanovii sono potenzialmente patogene, mentre le restanti non lo sono e di
queste si riportano le fonti e gli
habitats.
Fonti
di origine e habitats di Listeriaspp.
L.acquatica sp.nova (Den Bakker & Coll.2014) è presente nelle acque
dolci naturali.
L.booriae sp.nova (Weller & Coll.2015)è stata isolata da impianti di
lavorazioni alimentari.
L.cornellensis
sp.nova (Den Bakker & Coll,2014) è presente in acque dolci naturali.
L.fleischmannii sp.nova (Bertsch &Coll.2013) è sta isolata ed
presente in formaggi. L.fleischmannii
subsp.colarodonensis, subsp.nova (Den Bakker & Coll.2013) isolata da
suolo e prodotti agricoli di fattoria.
L. fleischmanni subsp.fleischmanii
subsp.nova ((Den Bakker & Coll.2013) isolata da suolob e prodotti agricoli
di fattoria.
L.floridensis sp.nova (Den Bakker & Coll.2014) isolata dall’ambiente
e da acque dolci nella Florida.
L.grandenensis, sp.nova( Den Bakker & Coll.2014) isolata da ambiente e acqua dolci naturali a
Grand,Colorado.
L.newyorkensis,sp.nova ( Weller & Coll.2015), isolata da
impianti di lavorazione alimenti in USA.
L.riparia, sp.nova ( Den
Bakker & Coll.2014 ) isolata da acque dolci naturali e da prodotti
agricoli.
L.weihenstephanensis,sp.nova
(Lang Halter & Coll.2013),isolata da una pianta acquayica di stagno la Lemna trisulca in
Fresing/Weihenstephan in Sud Germania
L.monocytogenes
La
specie denominata Listeria monocytogenes è così denominata per la sua capacità
di sopravvivere nei monociti ed è causa di monocitosi negli animali, ma non nell’essere
umano. Dopo 36 ore di incubazione su terreno agar sangue L.monocytogenes presenta una zona evidente di emolisi
intorno alla colonia. La specie fermenta L-ramnosio, ma non D-xilosio e la
cellula batteri casi muove con movimento
rototranlatoto su se stessa a temperatura ambiente,ma non a 37° C,tale
movimento è caratteristico (Seeleger & Coll.1986).
L.monocytogenes è comunemente divisa in 13 serovars. Di questi solo 4 serovars 1/2a,1/2b,1/2c e 4b
sono responsabili del 95 % o più dei casi di listeriosi umana. La specie ha una
struttura genetica clonale consistente
in 4 linee genetiche(lineages) dove la lineage I include i serovars 1/2a,1/2c,3a,3c , .La lineage II comprende i
serovars 1/2b, 3b,4 b,4d,4e.Nella lineage III sono presenti 4°,4b,4c e
nella IV sono situati i serovars ,4a,
4b, 4c 7 (Doumith & Coll.2004, Liu & Coll,.2010, Clark
&Coll.2010,Nightingale .2010,Orsi & Coll.2011,Tsai & Coll.
2011).Mentre la lineage I è altamente clonale, la lineage II mostra una maggiore
diversità e la presenza di un gene di trasferimento orizzontale(Nightingale
& Coll.2005). i sierotipi della linea genetica I sono prevalenti negli alimenti e negli ambienti di loro lavorazione
1/2a,1/2c. mentre i sierotipi 3a, 3c si
sono resi responsabili di casi sporadici di listeriosi in parecchi paesi
Europei e in Canada. I serovars della linea genetica II (!/2b,,4b) sono stati i
responsabili della maggior parte di casi di listeriosi nel mondo. I serovars
4d, e 4e hanno provocato casi sporadici di listeriosi in USA in Taiwan. I serovars della linea genetica
III (4a,4b,4c) sono di raro isolamento e provocano listeriosi negli animali.
Infine anche i serovars della linea genetica IV
sono di raro isolamento e causano listeriosi negli animali.
Fattori
di virulenza
La virulenza del batterio è condizionata da una serie di fattori,alcuni
propri del microrganismo stesso,altri costituiti dalla differente natura del substrato
alimentare e dalle condizioni dell’ospite in cui il batterio penetra (Hof
&Coll. 1992). Il processo infettivo evolve in patologia quando il batterio
attraversando la parete intestinale diffonde per via ematica e linfatica
raggiungendo inizialmente il fegato,in cui si moltiplica all’interno degli
epatociti,e la milza,quindi sempre per via ematica raggiunge gli organi bersaglio secondari:
cervello e placenta. Caratteristica di L.monocytogenes è la sua capacità di
superare le barriere dell’ospite (intestinale, ematoencefalica, materno-fetale)
unitamente alla capacità di sopravvivere ai meccanismi battericidi attuati dai
macrofagi oltreché di penetrare all’interno di cellule non fagocitiche (epatociti,
neuroni, ecc.).Il processo di internalizzazione prende inizio con la
sovrapposizione delle due membrane plasmatiche,batterica e cellulare,seguita
dalla progressiva interazione tra specifiche proteine batteriche di superficie
e i loro rispettivi recettori sulla cellula bersaglio (Cossart &
Coll.2008). L’internalinaA (InlA) e l’internalina B sono le più importanti
proteine di superficie coinvolte nel processo di penetrazione cellulare: di
queste sono state individuate almeno 25.
Esse legandosi a specifici recettori di membrana inducano il riarrangiamento del citoscheletro cellulare
inducendo la fagocitosi nelle cellule bersaglio. InlA si lega selettivamente al
solo recettore E-caderina delle cellule epiteliali umane in cui ne attiva la
fagocitosi, mentre InlB interviene
nell’invasione di un maggior numero di cellule, in particolare epatociti e
fibroblasti,attraverso l’interazione con almeno
tre recettori conosciuti Met,gC1qR e glicosaminoglicani. Tra questi il
più impo rtanteè il Met perché coinvolto nell’interazione con gli
epatociti,cellule del primo organo bersaglio in
corso di listeriosi (Cossart & Coll.2008 cit.Nivas Rosa 2011).
Un’ altra importante proteina è la p60 (Invasion Associated Protein) che
si ritiene anch’essa coinvolta nel processo di adesione del batterio alle
cellule eucaristiche e nella fase tardiva della divisione cellulare,per la sua
attività idrolasica nei confronti dell mureina (Vasquez-Boland & Coll.2001).
La permanenza della L.monocytogenes all’interno del fagosoma ha una
durata media non superiore ai 30 minuti, durante i quali per un verso si attiva per impedire l’azione
battericida della cellula ospite con una sintesi di una superossido dismutasi
(MnSOD) per l’altro sintetizza altri fattori di virulenza atti per la
disgregazione del fagosoma stesso. Nella distruzione del vacuolo litico
intervengono la Listeriolisina-O (LLO) e due fosfolipasi: la
fosfatidilinositolo-fosfolipasi C (PlcA) e Fosfatildilcolina-fosfolipasi
C(PlcB) (Crossart & Coll.2008 cit, Nives Rosa 2011).
La listeriolisina O è una tossina batterica appartenente alla classe
delle proteine tiolo-attivate, che attaccandosi alla membrana del fagosoma
induce in essa la formazione di pori,con conseguente alterazione degli
equilibri ionici e successiva disgregazione del fagosoma e liberazione del
batterio nel citoplasma. In questo processo la listeriolisina O è adiuvata
dalla PlcA o dalla PlcB.
La PlcA interviene nella lisi della membrana singola del fagolisosoma
primario, cioè originato a seguito della penetrazione diretta del microrganismo
nella cellula ospite, mentre la PlcB contribuisce alla lisi del vacuolo a
membrana doppia che si forma nel passaggio di L.monocytogenes nelle cellula
ospite alla cellula adiacente nel processo di diffusione intracellulare.
All’interno della cellula ospite L.monocytogenes si moltiplca attivamente
sintetizzando altri fattori di virulenza indispensabili per il completamento
del ciclo infettivo (Cossart & Coll.2008,cit.Nives
Rosa 2011), Tra questi la proteina ActA espressa sulla superficie batterica
attiva un complesso (Arp2/3) che provoca la polimerizzazione dei monomeri di
actina cellulare in una rete ramificata di filamenti che localizzandosi ad un
polo della cellula batterica (a formare la cosidetta comet tail) ne indirizzano
lo spostamento verso la membrana plasmatica della cellula ospite. Essa sotta la spinta di questa
formazione protrude verso l’esterno e il conseguente invagina mento della
membrana plasmatica della cellula adiacente avvia un nuovo processo di
fagocitosi nei confronti dello stesso microrganismo che lo ha prodotto, con
questo sistma L.monocytogenes può diffondersi nell’organismo passando da una
cellula all’altra senza venire in contatto con gli anticorpi presenti nei
liquidi organici.
Evidenza di
differenti livelli di virulenza delle specie di L.monocytogens
Per un considerevole periodo di tempo L.monocytogenes è stata
considerata patogena a livello di specie. Con una generale accettata
convinzione che tutti i ceppi di L.monocytogenes fossero virulenti, quindi
capaci di causare infezioni per via orale. Tuttavia, in base a dati
sperimentali ottenuti in questi ultimi anni,è apparso evidente che L
.monocytogenes ha una grande variazione di virulenza e di patogenicità a
livello dei serovars. (Veige & Coll.2010) Mentre alcuni ceppi epidemici
sono certamente molto infettivi,,altri (specialmente quelli isolabili da
alimenti e dall’ambiente) sono scarsamente responsabili di infezioni umane e
sono avirulenti. ( Tabouret &
Coll.1991, Corner & Coll. 1989,Van
Lagendom & Coll,1999,Roche & Coll.2001,Liu & Coll,2003,).Dei 13
serovars di L.mocytogenes solo 3 si sono resi responsabili del 96% delle
infezioni umane (1/2a,1/2b e 4b).Per quanto riguarda l’Italia i sierovars
responsabili sono stati identificati
come 1/2a,1/2b,!2c e 4b. e hanno riguardato solo 251 casi in 10 anni.Tranne
1/2c gli altri sierovars sno stati
responsabili del 92 % dei casi. Negli anni 2006,2009,20010, solo 10 casi sono stati attribuiti ai serovars
1/2c,3a,3b,4d (Mammina & Coll.2009,Pontello & coll.2012).Mutazioni
nelle proteine responsabili della virulenza o dei rispettivi geni sono indici
della diminuzione o assenza di virulenza dei ceppi (ad esempio : internalina A
troncata, o mutazione del fattore positivo di virulenza A,o sostituzioni di
basi che inattivano le differenti proteine di virulenza, o mutazione di Prfa (
Veige Coll.2010) Secondo questi ricercatori il 50-60% dei ceppi di Listerie
isolati da ambienti ed alimenti potrebbero
essere virulenti o poco virulenti. Putroppo attualmente non esiste alcun
metodo perfetto per riconoscere i ceppi con virulenza assente o attenuata.
Comunque l’infezione da Listeria monocytogenes si manifesta nel 0,03-0,11
per 100,000 persone,quindi con incidenza assai bassa. Differenti stati
(UE ,USA e Canada) hanno formulato regolamenti
e direttive riguardanti l’ accertamento quantitativo del rischio di salubrità degli alimenti con L.monocytones per il consumatore.
Per prevenire l’infezione per via alimentare da L.monocytogenes gli alimenti
sono strettamente controllati senza tener conto della virulenza o meno del
ceppo isolato e ,in caso di presenza l’alimento viene ritirato. Considerato, quindi,
che il rischio non è lo stesso per la presenza di un ceppo virulento ed uno con
bassa virulenza o virulento,la messa a punto di di metodi validi per valutare
il livello di virulenza dei ceppi di L.monocytogenes permetterranno di togliere dal consumo solo
quelli con presenza dei cloni virulenti.
Listeria
moniocytogenes e alimenti
Questo
batterio è stato trovato in numerosi
alimenti crudi e lavorati;la loro cottura la elimina,mentre la contaminazione
degli RTE può permettere la crescita della listeria in seguito a
ricontaminazione durante la durata della loro ita commerciale con possibile
rischio per il consumatore,In genere la contaminazione degli alimenti lavorati
è tipicamente dovuta da ceppi persistenti negli ambienti di lavorazione e
presenti per lunghi periodi. Non sempre è chiaro come i ceppi di
L.monocytogenes penetrino e nei locali di lavorazione e perché alcuni ceppi vi
permangono per tempi lunghi.
Listeria
monocytogenes può essere isolata da carcasse animali e alimenti in quantità variabili.
Percentualmente la sua presenza è stata
registrata nelle carni di pollo,in alcuni prodotti a base di carne fermentati,
in certi tipi di formaggi ed in alcuni prodotti della pesca come salmone
affumicato. La prevalenza di L.monocytogenes egli alimenti aumenta durante le fasi di lavorazione,Diversi studi hanno
dimostrato che i ceppi principali contaminanti i prodotti finali originano
dagli ambienti di lavorazione e sono differenti da quelli solati dalle materie prime.
Le attrezzature a struttura complessa
con larghe superfici come cutter,affettatrici,le multi aghi possono favorire la
disseminazione dei ceppi dei ceppi negli
alimenti preparati nello stabilimento.(Makkula 2013).Altre fonti di contaminazione,
oltre al contatto con le superfici delle macchine e degli utensili, sono i
guanti di gomma, il vestiario e le calzature degli operatori. Gli oggetti
contaminati più sovente sono, ovviamente le attrezzature più complesse, come refrigetatori, nastri trasportatori, affettatrici,
cubettatrici, iniettatrici di salamoia, cosicché possono divenire fonti di
contaminazione rendendo difficili le operazioni di pulizia e di
disinfezione.
L.monocytogenes, come prima
precisato, può persistere negli ambienti di lavorazione per anni. La
contaminazione persistente è tipicamente dovuta a pochi ceppi
reisolati costantemente dallo stesso sito o da altri luoghi insieme con
altri ceppi sporadici saltuari. I ceppi persistenti possono tollerare certi
tipi di disinfettanti meglio dei ceppi sporadici,probabilmente perché
aderiscono più tenacemente alle superfici a contatto con alimenti. Le cellule
adese resistono alla pulizia meccanica e alla disinfezione meglio di quelle
libere. L.monocytogenes aderisce alla superfici formando biofilms e la capacità
della loro formazione varia a secondo dei ceppi perché alcuni formano biofilms
con struttura tridimensionale simile a un micelio fungino,mentre altri ceppi
formano aggregati sparsi o biofilms a monostrato (Makkula 2013).La
contaminazione entra negli ambienti di lavorazione.oltre che dalle materie
prime anche dal suolo, tramite il personale,insetti e utensili vari
Listeria monocytogenes e agenti ostili
(stressanti)
Negli alimenti e nei locali di lavorazione L.monocytogenes viene a
contatto di vari agenti ostili (stressanti) che provocano cambiamenti nei
componenti della cellula e lesioni che influiscono negativamente sulla sua
vitalità,La severità degli agenti ostili può causare la morte della cellula o
la sua velocità di crescita e la sua virulenza. La moderna industria alimentare
tende a ridurre l’uso di conservanti per aumentare la vita commerciale dei prodotti,
cosicché la salubrità dell’alimento è sempre pi basata sulla catena del freddo.
La refrigerazione diminuisce la crescita di tutti i batteri ma la possibilità
di sviluppo di L.monocytogenes si
verifica al di sotto di 0°C.
Quindi le industrie devono ricorrere per forza all’uso
di agenti stressanti quali:
BASSE TEMPERATURE: diminuiscono
la fuidità del citoplasmae a permeabilità delle membrane. Rallentano il
metabolismo cellulare e le velocità cinetiche enzimatiche. Aumentano la
stabilità delle strutture secondarie di DNA e RNA,ostacolano o impediscono la
funzionalità dei ribosomi.
TEMPERATURE
ELEVATE: Denaturano proteine ed enzimi, danneggiano il DNA be degradano RNA; danneggiano
le membrane citoplasmatiche ed aumentano la fuoriuscita di componenti
cellulari.
ACIDITA’:
disturba il funzionamento degli enzimi e della bioenergetica cellulare.
Danneggia la membrana cellulare e al DNA.
ALCALI: alterano la
funzionalità degli enzimi, la divisione cellulare, disperdono il
contenuto cellulare.
BASSA Aw: si ha disidratazione della cellula con perdita di turgore. Si
verifica inibizione di assunzione di nutrienti e di altre funzioni essenziali
cellulari,è alterato il ripiegamento delle proteine.
ETANOLO:
aumenta la permeabilità della membrana cellulare,denatura e proteine e il loro
ripiegamento,produce la interazione di macromolecole in tutti i comparti cellulari.
H2O2,O2
E ALTRI AGENTI CON FORTE CON FORTE ATTIVITA’OSSIDANTE: per ossidano i lipidi
con conseguente diminuzione di fluidità della membrana cellulare. Danneggiano
il DNA e provocano la formazione di legami crociati tra DNA e altre molecole,
modificano la struttura delle proteine e del loro ripiegamento, quindi delle
loro funzioni. Formano aldeidi che aggravano il danno molecolare (Biblio in
Makkula 2013).
Riassunto
E’
stata riportata l’attuale tassonomia delle listerie spp nel genere Listeria.
Sono indicati i sierotipi virulenti,poco virulenti e virulenti della specie. Sono state segnalate
le varie fonti di contaminazione per l’industria alimentare ed,infine,sono
stati descritti agli agenti ostili (stressanti) nei confronti di
L.monocytogenes.
Updates
on Listeria ssp and L.monoccytogenes
The
current taxonomy of Listeria genus have been reported in detail. Virulent, low
virulent and a virulent strains of the serovars have been indicated. The
sources of foods and foods industries have been listed. Finally hostil agents
fisical chemical and their injurius actions have been described.
BIBLIOGRAFIA
Bertsch D.; Rau J.; Eugster M.R.;Haug M.C. & Coll.(2013) Int.J. Syst. Evol.Microbiol.63,526-532
Clark
C.G. ;Farber J.; Pagotto F.& Coll.(2010) Epidemiol.Infect.138,559-572
Conner
D.E.; Scott V.N.;Summer S.S.&Coll.(1989)
J.Food Sci.54,1553.1556
Cossart
P.:Toledo Arano A.(2008) Microbes and Infection 10,1041-1450 Den Bakker H.C.;Manuel
C.S.;Fortes E. D. & Coll. (2013) Int. J.Syst.Evol. Microbiol.63,3257-3268
Den Bakker H.C.;Warchoct S.;Wrigth E.M.& Coll.(2014)
int.Syst.Evol.Microbiol. 64,1882-1889 Lang Halter E.;Neuhaus K.;Scherer S.(2013)
Int.J.Syst.Evol.Microbiol.63.641-647
Domith M,; Cazalet C.; Simoes N-
& Coll.(2011)Infect.Imm. 72.1072-1083
Liu
D.;Ainsworth A.;Austin P.W.Coll.(2003)JMed:Microbiol.41.1065-1070
Liu O.;
Lawrence M.L. ;Viedmann M.& Coll. (2006 J.Clin. Microbiol. 44 229-4233 Makkula A. (2013 )Epidemiology and stress
responses of listeria monocitogenes Ac.Diss. pgg 1-78,Veterinary
Faculty,Univ.Helsinki
Mammina C.;Aleo C.;Romani Coll.(2009) J.Clin.Microbiol.47,2995-2930 Nightingale K.K;. Windham K.;Wiedman M. (2005)
J.Bacteriol.187,5537-5551
Nigthingale K. Listeria monocytogenes. (2010) JAOAC Int .93,1278-1286 Nives Rosa
M. (2010)Epidemiologia molecolare, fattori di
ptogenicità e di antibiotico resistenza Di Listeria monocytogenes
isolate da salsiccia ovina. Tesi Dott.Univ.Sassari pp 13-17
Orsi R.H.;Den Bakker H.C. ;Wiedman M.(2011)
Int.J.Med.Microbiol.391,79-96
Pontello M.;Guaita
A.Sala G.; Cipolla M & Coll.(2012) Ann.Ist.Sup.Sanità 48,126-150 Roche
S.M.;VeigeP.;Bottreau L.& Coll.(2001)
Int.J.Food Microbiol. 68,33-44 Seeleger H.P.R. & Jones D. (1986)
Genus Listeria in :P,H,A. Sneath;N.S.Mair.;
Sharpe M.E. and J.G Holt (eds)Bergey’s
Manual of Systematic Nacteriology. Vol 2,Williams & Wilkins, Baltimora USA pp.1235-1245
Tabouret
M.;De Rycke J.;Audurier A.& Coll.(1991) J.Med.Microbiol.34,13-18
Tsai Y.H.L.;Manon
S.B.;McGann K.K. & Coll.(2011)Inf.Gen.Evol.11,1881-1890
Van Langerdon
J.;Bottreau L.;Bailly S. & Coll.(1998) J.Appl.Microbiol.85, 357-360 Vazquez-Boland J.; Khun M.;BercheP &
Coll.(2001) Clin.Microbiol.Rev.,14,584-640
Veige P.& Roche S.(2010)
Future Microbiol 5,1799-1821
Weller D..Andrus A.; Wiedmann M: & Coll: (2015) Int.J. Syst.Evol.Microbiol.65,286-292
