Attività antibatterica di ac. laurico, monolaurina e lauroilarginato

Spezie, olii essenziali, acido laurico e suoi derivati sono impiegati nell’industria alimentare come agenti

naturali in grado di garantire la salubrità o per aumentare la durata della vita commerciale degli alimenti.

Gli antimicrobici ricavati dai vegetali sono ottenuti con varie tecniche da fiori, boccioli, semi, foglie, ramoscelli, corteccia, erbe, legno, frutti e radici delle  piante.

Alcuni degli estratti esercitano azione  antibatterica per gli olii essenziali particolarmente  presenti in

origano, aglio, cannella, cedro, coriandolo, prezzemolo, rosmarino, limone, salvia e vanillina (Tajkarimi  &coll. 2010).

Gli olii essenziali sono miscele di terpenoidi, sesquiterpeni, diterpeni insieme con idrocarburi aliftici, acidi,

alcoli, aldeidi, esteri aliciclici e lattoni (Fisher & coll.2006) .

Composti diversi, naturalmente presenti in natura o preparati per sintesi, dotati di attività antibatterica

sono l’acido laurico e i suoi due derivati monolaurina e argini nato laurico.

Si ritiene, ad esempio, che l’attività antimicrobica esercitata dal colostro umano sia mediata dall’idrolisi

dei trigliceridi ad opera della lipasi. Questo processo enzimatico libera acidi grassi(FA)e 1-monogliceri

(MG), i quali costituiscono la prima difesa dei neonati contro l’aggressione dei patogeni (Isaacs &coll.

2005).

Tra i componenti del colostro, gli acidi grassi a media catena (C-8 –C-14) ed i loro monogliceridi  sono 

attivi nei confronti di virus e streptococchi provenienti da bocca e naso di coloro che li accudiscono.

Oltre a ciò, è stato dimostrata la capacità di alcuni acidi grassi e dei loro monogliceridi di sopprimere

I geni responsabili dell’antibiotico resistenza e di provocare una frequenza di comparsa minore della

stessa nei batteri (Petshow & coll.1996; Ruzin & coll.!1998).

I composti citati non sono tossici ed è stato attuato il loro uso nel trattamento terapeutico di malattie

Infettive (Bergsson  & coll.2001,Nair & coll.2005;Rouse & coll.2005).

L’acido   laurico C-12) tra quelli a media catena esercita la più intensa attività antibatterica.

L’acido è presente  in alcuni alimenti come le noci di cocco,creme di cocco e  altri derivati in

concentrazioni elevate compreso  tra 11 e 37 g  della specialità e si trova anche nel latte materno in

quantità di 0,23 mg (USDA,1976,1982,1984,1998)

La monolaurina o  glicerolmonolaurato, glicerillaurato o 1_Lauroylac-glicerolo, é un monogliceride ottenuto dalla combinazione di glicerolo ed acido laurico. Il composto ha un effetto antibatterico pronunciato (Isaacs

& coll.2001;Preuss & coll.2005; Lieberman & coll. 2006;Carpo & coll.2007;Batovska

& coll.2009).

L’attivita antibatterica riscontrata dagli autori citati si è esercitata nei confronti di:

-Listeria monocytogenes

-Helycobacter pylori

-Haemophilus influenziate

-Staphylococcus aures

-Streptococcus agalactiae

-Streptococci gruppi A,B,F e G

-Bacillus antracis

-Mycobacterium terreum

In particolare lo studio di Batovska  & coll. (200)9,confermando  l’attività antibatterica di questo mono-

gliceride, ha dimostrato la sua maggiore efficacia rispetto a quella di altri monogliceridi come il  mono-

caprilico , il monocaprinico e il monomiristico .

La  monolaurina è stata utilizzata come conservante in prodotti a base di latte e nei cosmetici.

Un  terzo e nuovo composto  con acido laurico  è stato sintetizzato dai laboratori dai laboratori Miret

SA (LAMIESA,Spagna) ed   è  l’N’-L-arginina estere monoidrato   denominato LAE (Lauroilarginato estere) .

Le caratteristiche principali della molecola sono rappresentate da un’ ampia attività derivante dalla sua

struttura chimica di surfattant e alla sua tensioattività

Il prodotto è un   solido  igroscopico scioglibile in acqua fino alla concentrazione di 247 g/l con un punto

di fusione    compreso tra 50 e 58° C . Il suo coefficiente di partizione tra acqua e olio (soia,girasole,oliva)

è superiore a 10  ciò significa che  la molecola si localizza prevalentemente nella frazione acquosa, ove

si localizzano più facilmente i batteri (LIMA 2000).Tale proprietà avvantaggia LAE rispetto agli altri

conservanti non idrosolubili come  quelli prima citati.

LAE è stabile a pH compresi tra 3 e 7,mantenendo la sua attività antibatterica in questo intervallo.

Nel corpo umano LAE   è idrolizzato in composti naturali comunemente presenti negli alimenti consumati riuscendo innocuo consumatore.  La sua mancanza di tossicità  è stata documentata da molteplici  studi tossicologici (Ruckman & coll.2004 ,LMA031/004276;LMA050/04276.2000) cosicché il 1° settembre 2005 la FDA ha riconosciuto il composto come sostanza GRAS(Generalmente riconosciuta come innocua) permettendo il suo impiego come conservante in parecchie categorie di alimenti fino alla concentrazione ppm. di 200. Precedentemente l’USDA aveva concesso il suo impiego nelle carni, comprese quelle del pollame.

Proprietà antibatteriche in vitro

Nelle tabelle seguenti sono riportate le concentrazioni minime inibenti nei confronti di germi Gram pos

negativi,lieviti e muffe espresse in microgrammi/ml.(Manresa .2004)

Tabella n.1  MIC inibenti germi Gram positivi e Gram negativi.

Germi Gram positivi                                           mcg/ml       Germi Gram negativi                           mcg/ml

Alyciclobacillus acidiphilus  DSMZ 14558               8            Alcaligenes faecalis  ATCC 8750              14

Arthrobacter oxydans .    ATCC                                64          Bordetella bronchiseptica  ATCC 4817 126

Bacillus cereus var.mycoides ATCC  11778            32          Campylobacter jejuni ATCC  29428            8 

Bacillu s subtilis ATCC  6633                                     16          Campylobacter jejuni HC                            16

Clostridium botulinum  ATCC 19397                       64          Citrobacter freundii ATCC 22636              64        

Clostridium perfringens ATCC   77454                    16          Enterobacter aerogenes ATCC 13048       3

Clostridium perfringens ATCC 25601                      16          Enterobacter faecalis ATCC 27285              4

Lactobacillus  curvatus ATCC 25601                        16          Enterobacter sakazakii* ATCC 29544        32

Lactobacillus delbrueckii sp lactis  ATCC 10705     16          Escherichia coli 0157:H7 ATCC8739          32

Lactobacillus paracasei ATCC   25302                      16          Klebsiella pneumoniae  ATCC 4352           32

Lactobacillus plantarum ATCC 8014                         16          Proteus mirabilis   CECT 170                      32

Listeria monocytogenes   B4/97                                8            Pseudomonas aeruginosa ATCC                32

Listeria monocytogenes ATCC 15313                       32          Pseudomonas fluorescens ATCC13430    32

Leuconostoc  mesenteroi  des ATCC  19255             32        Salmonella cholerasuis  ATCC13076         8

Micrococcus luteus ATCC  9631                                128        Salmonella typhimurium ATCC 14928      32

Microbacterium phlei  ATCC 41423                          2            Shigella dysenteriae                                     8

Staphylococcus aureus ATCC 6538                           8            Serratia marcescens ATCC  10759             32

                                                                                                      Yersinia enterocolitica ATCC 27779           16

                                                                                                      Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802       128

*Ora Chronobacter.

 

Tabella n 2  MIC inibenti lieviti e  muffe

Lieviti                                                    mcg/ml                                   muffe                                         mcg/ml

Candida albicans ATCC 10231                 10                               Aspergillus niger  ATCC 14604              32

Rhodotorula rubra C4645ECT 1158                 16                      Aureobasidium pullulans ATCC9348    16

Saccharomyces cerevisiae ATCC9763      32                               Gliocadium  virens ATCC 6205               16

                                                                                                          Chaetonium globosum   ATCC 6205      16

                                                                                                           Penicillium chrysogenum ATCC 9480    128

                                                                                                           Penicillium  funiculosum CECT2914       16

Altri esperimenti sono stati eseguiti per valutare  la MIC  sporicide di LAE nei confronti di Geobacillus

stereothermophilus, Thermoanaerobacterium  thermosaccaharolyticum e Clostridium sporogenes.

L’attivita sporicida del composto è risultata di 216 mcg/ml per Geobacillus stearothermophilus, di

102 mcg/ml per Thermobacterium thermosaccharolyticum e di 51 mcg/ml per Clostridium sporoge-

nes (Università di Barcellona. Comunicazione personale).

 

Meccanismo di azione

Le  capacità antimicrobiche   di LAE sono dovute alla sua azione sulla membrane citoplasmatiche

che impedisce i processi metabolici ed il loro ciclo normale senza lisare la cellula microbica (Rodri-

guez & coll.2004). Per esempio, gli effetti di LAE sui batteri Gram negativi (Salmonella  typhimurium

ATCC 14028) e Gram positivi (Staphylococcus aureus ATCC 6538) sono stati esaminati trattando i

due microrganismi con le loro concentrazioni minime inibenti di 32 e 8 mcg/ml rispettivamente

riscontrando alterazioni delle membrane citoplasmatiche con conseguente  modificazione alterati-

va del potenziale  di membrana. Non si è registrata,inoltre,comparsa di resistenza (Rodriguez & coll.

2004)

Conclusione

LAE 8 commercialmente Miramat) è un prodotto antibatterico innocuo  rapidamente idrolizzato nei

suoi due componenti naturali nel tratto gastroenterico:

Numerosi studi tossicologici hanno confermato la sua innocuità: le prove hanno preso in considera zio-

ne  la sua metabolizzazione negli animali   e nell’essere umano,hanno valutato la mutagenicita,la

tossicità acuta,sub cronica e cronica,l’effetto sull’apparato riproduttivo  e lo sviluppo della tossicità

dopo trattamento (Ruckman & coll.2004).Tutti i protocolli sperimentali delle prove sono riportati nelle EFSA

Opinions  SCCP/0873/04,SCCP/1106/0708/ in Efsa  Journal 2012 (14,2652-2666)   e nell’Australian   full

Report STD 130).Attualmente il prodotto   in via di approvazione per essere inserito nella lista degli

additivi per alimenti della UE.

 Riassunto

Vengono descritte le attività antimicrobiche  e in particolare quelle di un nuovo  antibatterico

di  possibile impiego  negli alimenti il Lauorilarginato (LAE)

Summary

Antibacterial  activity of Lauric acid,Monolaurin and Lauoryl arginate

The  antimicrobial  activities of lauric acid,monolaurin  and laourylarginate have been  reported in

the text. The  new  antimicrobial compounds Lauroyl arginate have been outlined in detail.

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Clostridi psicrotolleranti e rigonfiamento di confezioni di carni refrigerate sottovuoto in imballaggi plastici

Carlo Cantoni. Libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale. Milano

Recentemente i sono registrati nuovi episodi di rigonfiamento di carni sottovuoto refrigerate come già avvenuto in anni precedenti. Si è quindi ritenuto utile fornire  informazioni su questa alterazione fornendo anche le più recenti  conoscenze ottenute dai ricercatori su questo argomento. Storicamente il rigonfiamento delle confezioni  contenenti carni refrigerate mantenute sottovuoto causata da clostridi psicrotolleranti  si manifestata per la prima volta nel 1989. Due gruppi di ricercatori,lavorando il primo negli Stati Uniti (Kalchayanand & coll.1989) e il secondo nel Regno Unito (Dainty & coll.1989) identificarono un Clostridium sp quale responsabile dell’alterazione. Le confezioni apparivano gonfie per la formazione di un gas “di odore disgustoso  con presenza contemporanea di liquido liberatosi dal tessuto muscolare”.la carne presentava un colore smorto e poca consistenza (Kalchayanand.1989).In tempi successivi fu identificato il microrganismo responsabile e venne denominato Clostridium estherteticum da Collins & coll nel 1992. I clostridi pscrofili e psicrotrofi (psicrotolleranti) sono stretti aerobi ed stato chiarito che il rigonfiamento è dovuto alla contaminazione della carne con endospore resistenti. Queste contaminano gli ambienti di lavorazione della carne provenendo dalle pelli e degli animali da macellare e  vengono,poi,trasferite alle carcasse durante le operazioni di disossamento. Il miglior metodo per controllare il rigonfiamento da clostridi psicrotolleranti  basato sull’applicazione delle più rigorose  modalità igieniche possibili.Infatti le spore sono molto resistenti al calore, alle radiazioni UV e ai disinfettanti.

Caratteristiche dell’alterazione

I clostridi responsabili del rigonfiamento maleodorante delle confezioni delle carni refrigerate identificati sono stati identificati come C.estherteticum, C.laramiense, C.gasigenes e C.frigidicarnis. Ultimamente Moschonas & coll., (2011,2013) hanno isolato un nuovo clostridio da pelle  di bovino, potenziale causa di rigonfiamento. Il ceppo, denominato TC1 provvisoriamente, è sottoposto ad analisi fenotipiche, chemotassonomiche e genotipiche, è risultato una nuova specie. Inoculato in campione di carne confezionata sottovuoto  ha provocato il  rigonfiamento (bombaggio) dell’alterazione dopo 42 giorni di incubazione. E’ un nuovo clostridio di  considerevole importanza economica per l’industria della carne bovina. Altri clostridi psicrotolleranti non produttori di gas ma anch’essi agenti di alterazione delle carni sono stati identificati,precisamente: C.algidicarnis, C.algidixylanolyticum. Tassonomincamente, l’inclusione di un microrganismo nel genere Clostridium è basata su quattro caratteristiche morfologiche: la capacità di formare endospore, un metabolismo strettamente anaerobico l’incapacità di ridurre il solfato e la Gram positività della cellula. Tra i numerosi ceppi di clostridi è presente un’ampia diversità. L’analisi del 16S rDNA ha rivelato l’esistenza di 19 o 20 clusters (gruppi) tra i clostridi. Le  specie alteranti i prodotti carnei refrigerati confezionati sottovuoto sono tutti psicrofili o psicrotrofi e fanno parte dei gruppi 1 e XIV, tranne il clostridio TC1 Che non rientra nei due gruppi (Broda &coll.2002: Moschonas & coll.2013). In questa relazione si adottano le seguenti definizioni: PSICROFILI, temperatura ottimale di crescita 15°C o meno; temperatura massima di crescita da15 a 20°C; temperatura minima di crescita da -5 a 5°C. PSICROTROFI: temperatura ottimale di crescita tra 25 °C e 30°C; temperatura massima di crescita tra 30°C e 35°C; temperatura minima di crescita da 4°C-5°C. PSICROTOLLERANTI:il termine comprende i ceppi capaci di svilupparsi alle temperature di refrigerazione a partire da -5°C.Quindi i ceppi di C.estherteticum (C.estherteticum subsp. esterteticum e C.esterteticum subsp laramiense) originariamente isolati da carni refrigerate sottovuoto sono veri psicrofili. Le due sub specie estherteticum e laramiense hanno una temperatura ottimale di crescita di 6-8°C e di 15°C rispettivamente (Collins 1992) Il gas prodotto dai due clostridi contiene idrogeno, anidride carbonica, butanolo e  ac. butanoico (butirrico) in elevate concentrazioni, esteri e composti solforati. Il secondo produttore di gas, il C.gasigenes è uno psicrotrofo con una temperatura ottimale di crescita tra 20 e 22° come C.algidicarnis, la cui temperatura ottimale di crescita è tra 25°C-30°C. Anche il quarto clostridio, il C.frigidicarnis si sviluppa a 30-38 °C rientrando anch’esso in questa categoria. Complessivamente i clostridi psicrotolleranti isolati da carni sono: C.algidicarnis, C.algidixilanolyticum, C.estherteticum, C.laramiense, C.frigidicarnis, C.gasigenes e Clostridium TC 1. Altri clostridi psicrotolleranti sono stati isolati da terreni, fanghi permafrost e da acque: C.algarophilum, C.bowmanii, C.lacusfryxellens e C.tagluense ( Spring & coll. 2003; Shcherbakova & coll. 2005; Sustin & coll.(2009).

Presenza di clostridi psicrotolleranti in carni refrigerate confezionate causa di rigonfiamenti (bombaggi)

I prodotti carnei presenti nelle confezioni rigonfie sono stati: tagli carnei di bovino, ovino, cervo, arrotolati carnei cotti per cani, tacchino precotto, roastbeef e vari prodotti carnei. Tutti alimenti contenuti in imballaggi di materiale plastico impermeabile all’ossigeno. Le confezioni rigonfie per presenza di C.estherteticum sono state riscontrate negli Stati Uniti, Nuova Zelanda, Irlanda, Sud Africa (Helps & coll.1999). C. estherteticun subsp lameriamiense è stato isolato nel Nord America (Kalchayanand & coll.1993). C.gasigenes è stato isolato in carni in Irlanda, Regno Unito e Nuova Zelanda (Cavill & coll.2011). C.frigidicarnis e C.algidixilanolyticus sono risultati responsabili di alterazione di carni confezionate sottovuoto  preparate in Nuova Zelanda (Yang & coll.2009). C.algidicarnis è stato isolato da carni suine cotte nel Nord Europa (Lawson & coll.1994) e da carni refrigerate in Nuova Zelanda  sopratutto cosce e lonze suine (Boerema & coll.2002). Le carni ovine sono risultate più contaminate rispetto a quelle bovine (Amin & coll. 2011). In Italia, nonostante i numerosi casi registrati non è stato possibile isolare i clostridi responsabili per errori  dovute alle tecniche d’indagini adottate.

Condizioni che permettono a crescita dei clostridi psicrotolleranti nelle carni confezionate sotto vuoto

Oltre a C.estherteticum e C.laramiense anche C.algoriphilum, C.bowmanii, C.frigoris, C. frigidicarnis, C.lacusfryxellense, C.psycrophilum, C.tagluense e C.vincenti sono in grado di crescere nel substrato carneo metabolizzando il glicogeno,il glucosio formatisi nel tessuto muscolare dopo la morte dell’animale. Quando il loro contenuto diminuisce quasi completamente, C. frigidicarnis utilizza per la crescita gli aminoacidi, mentre C.algidixylanolyticum e C.frigidicarnis utilizzano glicogeno, glucosio e lattato contemporaneamente durante la loro crescita e dopo  quando cessa. C.algoriphilum e C.frigoris cominciano ad utilizzare il lattato, utilizzando poi glicogeno e glucosio solo dopo il termine della loro fase di crescita, sebbene l’utilizzazione del lattato da parte di C. algoriphilum sia lieve. C.psychrophilum interrompe l’utilizzazione del glicogeno e del glucosio ma inizia una  lieve utilizzazione del lattato al termine della sua crescita. Le altre specie restanti C..esterthticum, C.bowmanii, C.gasigenes, C.tagluense e C.vincentii non utilizzano più alcun substrato dopo il termine del loro sviluppo. L’utilizzazione del glicogeno, glucosio e di quantità relativamente elevate di lattato  cessata la loro moltiplicazione da parte di C.algidixylanoliticum, C.frigoris e  C.frigidicarnis indica che questi microrganismi sono una causa potenziale, anch’essi di rigonfiamento delle carni refrigerate confezionate (BPS =blown pack spoilage) mentre tutti i restanti clostridi psicrotolleranti conosciuti non svolgono alcun ruolo in proposito (Yang & Badoni 2013).

Attuali possibilità di prevenzione del rigonfiamento delle confezioni di carni refrigerate sottovuoto.

Ricerche eseguite in Irlanda e  Nuova Zelanda in mattatoi hanno constatato che la contaminazione dei locali di lavorazione della carne deriva dalle pelli degli animali e che i clostridi sono pure presenti nelle feci  degli animali. Da queste fonti i clostridi vengono  a contatto con le carcasse durante le fasi di macellazione e di disossamento delle carcasse .C.estherteticum e C. gasigenes sono stati isolati dal suolo, dalle pelli grezze e dalle feci, ma non nei locali di sezionamento  e solo in limitate concentrazioni sui pavimenti contaminati dai calle calzature del personale  (np) (Moschonas & coll.2009). Al momento la  principale strategia da adottare in proposito è  basata sull’ applicazione delle GMP ( Good Manufacturing Practice) durante le fasi di lavorazione, prestando cura particolare nella fase di scuoiamento, evitando il passaggio di personale da questa zona al resto dei locali di lavorazione. Per la sanificazione degli ambienti e superfici  si deve obbligatoriamente ricorrere all’uso di disinfettante a base di acido perossiacetico. Altre strategie di intervento che hanno fornito qualche risultato, comunque con conclusivo, sono state l’aspersione di acido lattico sulle superfici delle carcasse, il loro lavaggio con acqua calda o  il trattamento con vapore. Tuttavia questi due ultimi trattamenti potrebbero riuscire controproducenti perché potrebbero far germinare le spore.

Tecniche per l’isolamento e l’identificazione dei clostridi psicrotolleranti

Le modalità di isolamento e di identificazione dei clostridi psicrotolleranti con i metodi tradizionali di batteriologia sono operazioni complesse richiedenti molto tempo per consentire la crescita dei clostridi (da 14 a 38-40 giorni) con l’incubazione delle colonie in stretta anaerobiosi  a 10°C di temperatura. Per il loro isolamento è necessario adottare il metodo di Lund & coll. (1990) che prevede  la sospensione del campione o dell’essudato in brodo preridotto (riscaldandolo) in terreno PYGS brodo e strisciandolo su Columbia Blood agar (CPA)addizionato del 5% di sangue di cavallo o di sangue di pecora (Boerema & coll.2003,  Moschonas & coll.2013). I campioni in esame alternativamente, possono essere trattati con ertanolo per eliminare i contaminanti salvaguardando le spore I ceppi isolati devono essere insemenzati in Reinforced Clostridium medium in stretta anaerobiosi. Per la successiva identificazione dei ceppi cresciuti si deve ricorrere all’esame del 16SrRNA. Un  metodo più rapido, ma solamente indicativo prevede la determinazione dei composto volatili del gas mediante GC/massa I composti di riferimento per C.estertheticum sono l’ac. butanoico (acido butirrico), l’a.butanolo, il 2-metil-etil-estere dell’ac. butanoico e il 3 metil butanolo-3.metil butanale.Possono essere presenti in tracce etanolo, 1-esaolo.1.propanolo(alcoli) Benzaldeide, eptanale, esanale (aldeidi). Cicloottano, etilbenzene,xilene (idrocarburi).2-butanone,-3-butanone.propanone.acido acetico. Dimetil solfuro, dimetil disolfuro, di metil trisolfuro (composti solforati)

Tabella riassuntiva di alcune caratteristiche di clostridi psycrotolleranti

Ceppo	Fonte	Temperatura ottimale di crescita (°C)	Intervallo crescita	PH	Tipo di alterazione
C algidicarnis	Carne sottovuoto	25-30	4-37	-	Alterazione superficiale
C.algidixylanoliticum	Carne sottovuoto ovino
C.estherteticum subsp estherteticum	Carne sottovuoto	6-8	1-15	6,5-7,2	Blown pack
C.estheteticum subsp. lameramiense	Carne bovina fresca roastbeef	Idem	Ideam	Idem	idem
C.frigidicarnis	Carne bovina	30-38,5	3,8-40,5	6,4-7,2	Alterazione superficiale
C.gasigenes	Carne ovina refrigerata	20-22	-1,5 – 26	6,2-8,6	Blown pack

                                       

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