Bacilli termofili obbligati e facoltativi in confezioni di latte UHT

Carlo Cantoni,libero docentein Ispezione degli Alimenti di origine animale.

Recenti isolamenti di  bacilli spp in confezioni di latte UHT hanno suggerito di disporre una relazione su loro presenza e tassonomia come riportato di seguito.Il  latte UHT,ottenuto sottoponendolo a un trattamento minimo di 135°C per1 sec.(ma normalmente trattato a temperature comprese tra 135°C e 150°C per 1-8 secondi in flusso continuo) seguito dall’im-mediato confezionamento in contenitori presterilizzati è virtualmente ve commercialmente sterile perchéil trattamento termico inattiva le forme batteriche vegetative e le loro spore.Dopo il riscaldamento il latteUHT è conservato a temperatura ambiente.Secondo le norme europee ,tale tipo di latte confezionato può contenere meno di 10 ufc/ml di cellule batteriche dopo incubazione a 30°Cper 15 gg.(Anonimo,1992).Le possibili alterazioni ,talvolta,si verificano in seguito a ricontaminazione durante  il  riempimento dei contenitori  sono dovute all’attivita proteolitica e lipolitica degli sporigeni termofili presenti nel latte e nei prodotti lattiero caseari( p.e.latte in polvere)i bacilli termofili sono evidenziati con il conteg-gio su piastre di terreno nutritivo per aerobi (PLAo APC agar) incubate a 55°C.

Distinzione tra i ceppi batterici sporigeni.

Gli sporigeni isolati con tale modalità dal latte UHT sono divisibili in due categorie:a)termofili obbligati e b) termofili facoltativi,denominati anche temotolleranti (Burgess & coll. 2010)I termofili obbligati crescono solo a temperature elevate( tra 40°e70°°C) e comprendono  le specie Anoxybacillus  flavitermus e Geobacillus spp. (Flint& coll.2001;Scott & coll.2007).

Gli  sporigeni termofili facoltativi appartengono al  genere Bacillus e  crescono alla temperature propriedei germi mesofili e a quelle dei termofili,secondo la specie.Alcuni esempi di questi sporigeni meso/ter-mofili sono B:licheneformis,B.coagulans,B:pumilus,  B. sporothermophilus e B.subtilis.(Burgess &coll.(2010).

Le caratteristiche  principali dei bacilli termofili sono:

-temperatura massima di crescita :45°-70.°°C

-temperatura minima di crescita 30-47°C

-intervallo di pH per la crescita 5,2-9,0

-degradazione della caseina da parte della maggioranza dei ceppi

-scissione dell’amido da parte della maggior parte dei ceppi.

Molti ceppi elaborano altri altri enzimi o dei prodotti metabolici che causano odori e difetti strutturali.

Fonti di inquinamentoLa provenienza dei ceppi sporigeni può essere identificata nelle stalle o negli impianti di trattamentotermico del  latte.Precisamente nelle stalle  il suolo è l’habitat principale degli sporigeni(!);il foraggio e le lettiere contaminate contaminano capezzoli e mammelle delle bovini e da queste i germi passano nel latte (II);il latte può subire una contaminazione crociata da foraggio insilato di scarsa qualità batte-riologica nel quale possono gli sporigeni possono essere presenti in quantita’ di 100-1000 ufc/ml (III);anche le macchine mungitrici sporche possono essere fonti di contaminazione così come le manualitànon igieniche praticate dagli addetti alla mungitura(IV-V).Negli impianti di trattamento de latte si possono trovare nei prepastorizzatori,nei preriscaldatori, e negli evaporatori e in altre parti degli impianti sottoforma di biofilms (Scott & Coll.20 

.

Caratteristiche dei bacilli termofili 

I membri del genere Bacillus ed i bacilli termofili obbligati hanno semplici necessità nutrizionali:non richiedono,infatti,specifici aminoacidi per la loro crescita e ,perciò,sono in grado di svilupparsiin terreni semplici come il triptone,soia,agar (TSA):La temperatura di crescita dei termofili obbligatiè di solito compresa tra 55°C e 65°C,variando tra le specie ed i singoli ceppi della stessa specie.

Per i Bacilli termofili facoltativi le temperature di crecita sono riportate nella tabella n 1.

Le specie principali di termofili obbligati sono:

-Anoxybacillus flavithermus

-Geobacillus  sterothermophilus

-Geobacillus thermoleovorans

Nella tabella n 1 sono riportate le caratteristiche dei bacilli termofili facoltativi ed obbligati

Tabella n 1 Caratteristiche di alcuni bacilli termofili

Specie                              Anoxibacillus                                 Geobacillus                       Geobacillus

                                         flavithermus                                 sterothermophilus            thermoleovorans

t°massima di crescita           65-72                                         65-68                                     70

t°minima di crescita              30-38                                        37                                           35-47

crescita anaerobica                si                                               no                                           no

intervallo di pH                     6.0-9.0                                        6.0-8.0                                 5,2-8.0

sporangio  ingrossato                  si                                                  si                                          si 

posizione  spora                    terminale                                terminale                           terminale

reazione  V-P                          positiva                                   negativa                             negativa

crescita in NaCl %                  no                                            no                                         si

Riduzione nitrato/nitrito      si                                             variabile                               si

Idrolisi  caseina                      si                                              variabile                              variabile

Idrolisi gelatina                     no                                            si                                            variabile

Idrolisi  amido                       si                                              positiva                                variabile

Specie                            Bacillus                   Bacillus             Bacillus               Bacillus            Bacillus

                                       licheneformis        subtilis              coagulans           pumilus       sporothermodurans t°massima crescita                 50-55           45-55                57-61                  50-55               45-55

t°minima crescita                   15                 5-20                  15-25                    5-15                20

crescita anaerobica              si                    no                      si                            no                  no

intervallo di pH                   5.2-8                5.5-8.5             4.0-10.5                5.5-8.5           non conosciuto

sporangio ingrossato             no                    no                      variabile               no                  no

posizione spora                centrale           centrale             sub terminale      centrale       terminale

reazione V-P                     +                         +                           variabile               +                    -

crescita in NaCl 7%           si                      si                             no                       si                    no

riduzione nitrato/nitrito  si                     si                           variabile               no                  no

idrolisi  caseina                  si                     si                             no                        si                   debole

idrolisi  gelatina                 si                     si                           variabile               si                   no

idrolisi amido                     si                     si                           si                            no                 no

Da Burgess & coll.2010

Il genere Geobacillus

Il genere è composto  da  almeno 19 specie con cellule bastoncellari che appaiono singole o in brevi catene mobili per mezzo di flagelli peritrichi. Sono Gram positive ,ma la colorazione può variare fino alla Gram negatività.Le endospore  entrola cellula  sono di forma ellissoidale o cilidrica e sono posizionate terminalmente o subterminalmemtein sottili sporangi leggermente rigonfi o meno.Nel  terreno solido di coltura le dimensioni delle cellule batteriche sono variabili.In certi terreni i ceppi prducono pigmenti.Sono batteri chemio organo trofici,aerobi o anaerobi facoltativi.L’ossigeno è un accettore di elettroni e può essere  sostituto dal nitrato per alcune specie.Sono ceppi obbligatoriamente termofili.Le temperature di crescita sono comprese tra 37°e 75° C,l’optimun di crescita è compreso tra 55°-65°C.La crescita avviene ad intervalli di  pH compresi  tra 6.0 e 6.5.Per la loro crescita non richiedono la presenza di vitamine,NaCl eKCL.

Le prove di identificazione richiedono la valutazione della loro attivita nei confronti di:

-carboidrati.I  Geobacilli produco acido ma non gas da glucosio,fruttosio,maltosio,mannosio e saccarosio. Molte specie non producono acido dal lattosio.La maggior parte delle specie produce catalasi,non deamina la fenilalanina,non degrada la tirosina e nonproduce indolo;è negativa alla reazione di Voges-Proskauer (V-P).La prova dell’ossidasi può risultare positiva o negativa.Le specie di Geobacillus fanno parte del genere Geobacilus,famiglia Bacilaceae,ordine Bacillales,classe Bacilli,phylum  Firmicutes.

Caratteristiche metaboliche di Geobacillus  stearothermophilus

Oltre alle caratteristiche riportate in precedenza i ceppi dela specie fermentano il glicerolo,il mannosioma non il lattosio e il galattosio.La sporulazione è una caratteristica fondamentale della specie.E’favorita dalla presenza nel terreno di cre-scita da solfato e da cloruro di manganese.Si produce in 10 giorni in substrato con pH 6-8,9.Il) G.stearothermophilus è impiegato per la produzione di diversi enzimi quali le alfa-amilasi resistentia  100°C per 1 h,la beta-mannasi  termostabile,la proteasi alcalina extracellulare termostabile,l’alfa -L  arabinofuranoside,la lipasi termostabile e la beta-xilosidasi.Il microrganismo è responsabile dell’alterazione detta “Flat sour” o inacidimento senza  produzione di gasdelle conserve appertizzate.In quelle a base di latte le sue spore possono trovarsi  oltre che nel latteùUHT nel latte concentrato scremato nei latti in polvere.

Caratteristiche di Geobacillus  thermoleovorans

A quelle già citate si aggiungono:lo sviluppo delle colonie nei bterreni di coltura con colore bianco espesso con color crema,rugose in superficie.E’variabile al test dell’ONPG e del V-P,non produce indolo,idrogeno solforato. E’ lisindecarbossilasi,ornitindecarbossilasi,ureasi,tripofandeaminasi negativo.Produce acido dal cellobiosio,melobiosio,lattosio non tutti i ceppi),raffinosio,saccarosio e trealosio.Non scinde gli altri zuccheri (Dinsdale & coll,2011)

Caratteristiche di Anoxybacillus flavithermus

Caratteristiche aggiuntive alle precedenti sono le seguenti;catalasi e ossidasi positivo.Cresce su terreno con estratto di lievito,agar.Utilizza glucosio,mannosio,,maltosio,saccarosio,arabinosio,ramnosio e sorbitolo.Produce  acetoina ,  arginindecarbossilasi,lisinadecarbossilas,triptofandeaminasi, e betagalossidasi.Non produce ureasi,ornitindecarbossilasi,indolo e idrogeno solforato. Non cresce a 68°C (Pitula &coll.2000,Burgess & coll.2010).Anoxybacillus  flavithermus  fa parte del genere Anoxybacillus  (18 specie),famiglia Bacillaceae,ordineBacillales,classe Bacilli,phylum Firmicutes.

Bacillus  sporothermodurans  e altri bacilli sporigeni termoresistenti nel latte UHT.

Nel latte UHT possono trovarsi alune specie di bacilli  con spore resistenti ad alte temperature come Bacillus cereus,B.sphaericus,B:licheneformis ,Brevibacillus brevis e due altre specie con forte capacità alterante;B.sporothermodurans e Paenibacillus lactis.Il B. spothermodurans è stato descritto da Pettersson  & coll, (1996).Le principali caratteristiche del Bacillo sono riportate nella tabella n 1.Sue spore resistenti a 140°C per pochi secondi sono state isolate da diversi prodotti a base di latte (crema,latte con cioccolato,latte in polvere e latte ricostitutio) (Hammer&coll.2000)   alterati in seguito alla germinazione delle spore e alla moltiplicazione delle forme vegetative.La specie B.sporothermodurans è geneticamente eterogenea  avendo cloni diversi raggruppabili in tre grup-pi:I,II,III.  Del primo gruppo fanno parte 16 ceppi,nel  II e III sono collocati  3 ceppi ciascuno. Nella tabella n.1 sono riportate le caratteristiche distintive della specie.I ceppi per la crescita richiedono la presenza divitamina B 12 nel terreno di coltura.Le colonie   sul terreno BHI agar si presentano piatte,circolari,intere,di colore beige o crema.Hanno spore sferiche o ellissoidali situate in posizioni para centrale o subteminalee qualche volta terminale con sporangi talvolta ingrossati.Producono acido da glucosio,D-fruttosio e malto sio e deboli quantità da saccarosio e trealosio.Possono acido(nonsempre)daamigdalina,arbutina,cellobiosio,gentobiosio,gliceroloemannitolo,D-mannosio,melezitosio,metl-D-glucoside,salicina,amido (debole)D-tagatosio,turanosio e Xilitolo(Heyndrix & coll.2012)La specie fa barte del genere Bacillus (191 specie),famiglia Bacillaceae.ordine Bacillacles,classe Bacilli,phylum Firmicutes.

Brevibacillus brevis

I Brevibacillus sono bastoncini Gram positivi,mobili con flagellimperitrichi.Hanno spore ellissoidali entro sporangi rigonfi. Le colonie sono piatte,lisci,circolari,intere.Aerobi stretti,catalasi positivi e ossidasi negativi.VP,idrogeno solforato ,indolo e leciti nasi negativi.Riduconoi nitrati a nitriti.Idrolizzano caseina,gelatina e DNA ma non amido ed urea.Crescono a pH  5.5-5.6.La loro crescita è inibita dal 2% diNaCl.La temperatura ottimale di crescita è di 30C,la minima è 20°C e la massima 50°C.Producono acidoma non gas  dal D-fruttosio .La produzione di acidoè variabile da D-glucosio,maltosio e D-ribosio.Non scindono altri zuccheri (Shida & coll.1995)

Paenibacillus lactis

P.lactis è stato isolatoda latte non trattato e da latte UHT da Schedelman & coll.(2004).Sebbene le sporedel bacillo non fossero predominanti in questo tipo di latte,esse sono risultate derivare dal mangime.Le spore resistono alla temperatura di 120 °C.Le cellule del bacillo appaiono singole,diritte con le estremità arrotondate,ma muovendosi appaiono curve.Sono  Gram negative e Gram variabili.Le  endospore sonoelissoidali o cilindriche e sono posizionate subterminalmente o,occasionalmente,paracentralmente,usualmente ingrossano lo sporangio.Le colonie si sviluppano su TSA in quattro giorni e si presentano opache,di color crema,leggermente convesse,rotonde con margini frastagliati e trasparenti.Le microcolonie,mobili,si distribuiscono sulla superficie dell’agar in senso orario.Sono  aerobiche.La temperatura massima di crescita è tra 50° e 55°C,mentre quella ottimale è compresa tra 30° e 40°C.Il pH ottimale per lo sviluppo è 7,quello minimo è tra 5.0 e 6.0,il pH più elevato  di sviluppo è tra 10,5 e11.I bacilli non idrolizzano la caseina,ma scindono il beta-D-galattopiranoside.La riduzione del nitritoè è variabile.Negativesono le prove e di arginindiidrolasi,lisindecarbossilasi,ornitindecarbossilasi,utilizzazionedl citrato,produzione  di idrogeno solforato,,ureasi,triptofano deaminasi,produzione di indolo idrolisi della gelatina.La reazione VP ènegativa o debolmente positiva.I bacilli idrolizzano l’esculina e producono acido da amigdalina,L-arabinosio,arbutina,D-cellobiosio,D-fruttosio,D-glucosio,glicogeno,lattosio,maltosio,mannitolo,D-mannosio,D-melibio-sio,D-raffinosio,ribosio,amido,saccarosio e D-trealosio.La produzione di acido è ceppo dipendente per D-arabinosio,L-fucosio,galattosio,gentobiosio,gluconato,D-melezitosio,metil-D-glucoside,metilxiloside , N-acetilglucosamina e salicina.Alcuni ceppi danno deboli reazioni on i seguenti substrati:amigdalina,L-arabinosio,arbutina,D-cellulosio,D-fruttosio,D-glucosio,mannitolo,D-mannosio,D-melizitosio,D-raffinosio,saccarosio,D-mannosio e D-xilosio.I ceppi di Paenibacillus lactis fano parte del genere Paenibacillus,famiglia Paenibacillaceae,ordine Bacil-lales,classe Bacilli,phylum Firmicutes.

Potenziale capacità alterante di bacilli termofili  obbligati e di termofili  facoltativi.

Ceppi di termofili obbligati e di termofili facoltativi producono acidi organici e vari enzimi termostabiliproteinasi e lipssi,alterando così latte e derivati .I termofili obbligati posseggono una bassa capacità alterante poiché il latte ed i suoi derivati sonocon-servati a temperature inferiori a 37°C e a questa temperatura non crescono.Maggiormente alterantisono,invece,i ceppi dei termofili facoltativi.Le alterazioni da essi prodotte sono riportate nella tabekaseguente.

Tabella 2, Tipi di alterazioni di latte UHT causate da termofili

Alterazione                                                                  agente responsabile

Inacidimento                                                              Bacillus spp

                                                                                      Bacillus coagulans

Coagulazione dolce                                                   Bacillus spp

                                                                                     Geobacillus stearothemophilus

                                                                                    Paenibacillus lactis

Rigonfiamento del contenitore                              Bacillus spp.

Viscosità                                                                     Bacillus subtils

                                                                                     Bacillus licheneformis

Odori e sapori sgradevoli                                        B:cereus

I termofili obbligati non sono patogeni.Alcuni termofili come B-licheneformis,B.pumilus e B.subtilis possono elaborare tossine,ma solo a 30° e 37°C (De Jonge & coll.2009),B.cereus  altera il latte chediventa imbevibile.I tre bacilli primi citati si ritiene siano stati implicati in episodi di intossicazione(Griffith 1955,Pavic 2005).

Termoresistenza delle spore dei termofili

Nella tabella n.3  sono riportatele termoresistente delle spore di termofili obbligati e facoltativi

Tabella n.3 Termoresistenza delle spore

                                                                         °C                                      sopravvivenza

Geobacillus sporothermophilus                121°C                                D= 42 sec.

   “                        “                                          121°C                                D=7,3 sec.

   “                        “                                          143°C                                 4 sec

Anoxybacillus flavithermus                         143 °C                                3 sec.

Bacillus  licheneformis                                  120°C                                 3 sec-

      “                  “                                              125°C                                  4 sec.

Bacillus subtilis                                               120°                                   4 sec.

Bacillus pumilus                                               135°C                                10 sec.

Bacillus  sporothermodurans                        125°C                                 5 sec. D=2 min.;D=13 

Da Burgess & coll.(2010)

Presenza di termofili nel latte e biofilms quali fonti di contaminazione

Il  livello di termofili nel latte è,in genere,inferiore a 10 ufc/ml (Hill & coll.1994;Guiggon & coll.2002)solo in certe occasioni si sono riscontrate concentrazioni superiori a 100 uf/ ml..I termofili predominanti sono B:licheneformis e B.coagulans ma nel latte UHT sono presenti solo G:sporothermophilus  e A.flavithermus.I termofili nell’impianto di pastorizzazione possono trovarsi nei biofilms.L’adesione dei batteri alle superfi-ci e il conseguente sviluppo in biobilm è una evenienza comune in ambienti naturali e negli impianti indu-striali.I biofilms sono definiti come  microcolonie di cellule batteriche racchiuse in una matrice extracellu-lare di sostanze polimeriche (EPS)sviluppatesi rapidamente sulle superfici.La formazione di un biofilm si  verifica in tre fasi: 1)Fase I (entro 1-10 sec.) su superfici  ricoperte dacomponenti proteici del  latte e con calcio fosfato. 2)Fase II entro 6-8 ore)avviene la colonizzazione primar-ria delle cellule  batteriche nel substrato con formazione di esopolisaccaridi che supportano il processo. 3)Fase III: si verifica la stabilizzazione irreversibile dei biofilms.Sono biofilms maturi con  le cellule battericheInclusi in canali entro la matrice organica.La formazione dei biofilma avvenga nelle parti dell’impiantodiLavorazione  a temperature comprese tra 45° e 65 °C.Da queste formazioni si liberano i batteri che poi passano nel flusso del latte ed è quindi necessario trattarlo 150°c per  accertarne la distruzione.

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Riassunto

Alcune volte il latte UHT risulta contaminato da bacilli termofili e termofili facoltativi 

come si è verificato recentemente.Si è quindi ritenuto opportuno   redigere una relazione

aggiornata sulla situazione come risulta dalle lettura del testo.

Summary

Thermophilic  bacilli  in UHT  milk

The obligate  and facultative thermophiles  whichb to be presente in UHT hbave been

 described in details.Their taxonomy, thermoresistent,spoilage capacity,endospores ,biofilm formation

and others characteristics have been also described

Alimenti ittici e batteri luminosi
Prof. Carlo Cantoni1
Dott. Stefano Ibba2
Sebbene non siano spesso notificate, diversi prodotti della pesca, inclusi quelli comunemente conservati in frigorifero, appaiono luminescenti quando sono tenuti al buio. Molte segnalazioni sono dovute a ristoratori e a consumatori  quando tengono gli alimenti ittici a temperatura ambiente e allo scuro.
Ancora oggi parecchi consumatori ritengono che la luminosità di questi alimenti sia dovuta al fitoplancton fosforescente o fluorescente mentre la luminescenza degli alimenti ittici non è dovuta a radiazioni o a fluorescenza (che richieda la luce ultravioletta per provocare la reazione)ma è conseguente allo sviluppo di certi batteri capaci di emettere luce.
La luminescenza,o luminosità batterica,è provocata da una reazione chimica mediante la ossidazione di un flavinmononucleotide ridotto e di una aldeide a lunga catena per l’intervento dell’ossigeno molecolare che da luogo a flavina ossidata, un acido grasso e luce.
La quantità di luce emessa dai batteri luminosi dipende dalla composizione del substrato di crescita,o dal terreno utilizzato per la loro crescita,dalla temperatura di incubazione o di mantenimento dell’alimento,dalla densità della popolazione batterica e dalla specie, o da ceppi della stessa specie.
La maggior parte dei batteri luminosi richiede la presenza di sale eccetto due batteri non marini luminescenti.
I batteri luminosi sono presenti liberi nelle acque degli oceani,sulle superfici cutanee e nell’intestino dei pesci, di molluschi) e dei crostacei (granchi e gamberetti) così come simbionti in organi luminosi specializzati di alcuni pesci e molluschi (calamari e seppie).
Per esempio ceppi di Photobacteriumphosphoreum  sono presenti in pesci viventi in acque marine profonde,mentre ceppi di P.leognatiisono stati isolati da pesci viventi in acque temperate e tropicali.
I batteri luminosi appartengono ai generi Aliivibrio, Lucibacterium, Photobacterium, Shewanella e Vibrio.
La maggior parte dei batteri luminosi crescono anche alle temperature di frigorifero (4°C,) ma P.Phosphoreum ed A.logey sono in grado di moltiplicarsi a temperature più basse.
Questi microrganismi non sono considerati nocivi perché non sono mai stati segnalati casi di malattia dopo la loro ingestione.
Non tutti i prodotti ittici permettono la loro crescita e ciò è dovuta alla insufficiente presenza di ioni sodio o di sale nelle loro carni,mentre  alimenti ittici cotti,quali carne di granchio,gamberetti prodotti ittici ricostituiti tipo surimi, contenendo sale, aggiunto durante la loro preparazione, sono substrati favorevoli alla loro proliferazione.
La contaminazione si verifica durante la loro lavorazione nei punti critici (CCP) successivamente segnalati. Per questi motivi questo tipo di alimenti sono quelli più frequentemente colpiti dalla luminescenza.
Uno sviluppo più lento e contenuto del numero dei batteri luminosi può ottenersi refrigerando i prodotti ittici in questione a 0°C e consumandoli entro due giorni dal loro acquisto.
Recentemente, in seguito a nuovi episodi di luminescenza di gamberetti cotti causati da P.phosphoreum, e per le modificazioni tassonomiche e sistematiche dei batteri luminosi avvenute in questi ultimi anni si è ritenuto opportuno riferirne in proposito.
A questo scopo nella tabella n.1 sono stati riportati i generi e le specie dei batteri luminosi con le rispettive temperature di crescita e le concentrazioni di sale alle quali si sviluppano.

Tabella 1 Genere specie di batteri luminosi,temperature di crescita e concentrazioni di sale alle quali si sviluppano
Genere/specie                                                    temperatura                          NaCl (%)                                      
Aliivivibrio (famiglia: Vibrionaceae, ordine: Vibrionales,classe: Gammaproteobacteria,phylum : Bacteria)                
A:fischeri                                                                 10-30°C                                0,9-3
A.logei                                                                      0-30°C                                  0,5-5
A.sifiae                                                                     4-30°C                                   0,5-3
Lucibacterium (famiglia: Vibrionacee, ordine: Vibrionales,classe: Gammaproteobacteria:phylum:Bacteria)
Lucibacterium  harvey (Vibrio harvey)                10-27 °C                                 3-6
Photobacterium  (famiglia :vibrionaceae;ordine:Vibrionales;classe Gammaproteobacteria, phylum:Bacteria)
P.ganghwense                                                            10-45°C                                           1-7
P.histaminum                                                             20-40 °C                                        2 -6
P.iliopiscarium                                                             4-22 °C                                          1-3
P.kishitani                                                                    4-30°C                                           3      
P.leiognathi                                                                 10-30°C                                         0,9-3
P.phosphoreum                                                           0-25°C                                         0,2-3,8
Shewanella  (famiglia:Shewanellaceae,ordine:Alteromonadales;phylum;Proteobacteria;Regno :Bacteria)
S.haneday                                                                   4-25 °C                                         0-3,8
S.woody                                                                       4-25°C                                          0-3,8
Vibrio (famiglia:Vibrionaceae,ordine :Vibrionales;classe: Gammaproteobacteria; phylum:Proteobacteria; regno:Bacteria).
V.azureus                                                                       10-37°C                                       0,5-6
V.communis                                                                    7 °C                                             0-8
V.orientalis                                                                      4-35°C                                          1-8      
V.sagamiensis                                                                 10-37 °C                                        0,5-5
V.splendidus                                                                      4-28°C                                        0,5

Quanto alla produzione di luce i singoli ceppi hanno comportamenti diversi evidenziati nella tabella n.2, nella quale sono indicate le condizioni ottimali alle quali i batteri emettono luminosità.
Tabella n.2 Emissione di luce da parte di alcuni batteri luminescenti
- Aliivibrio fischeri si sviluppa tra 10 °C e 30°C e non a 4°C emette una luce di debole intensità.
-Aliivibrio logei  Cresce a 4°C e molti ceppi della specie emettono luce intensa.
-Lucibacterium  harveyi. Molti ceppi della specie sono luminescenti
Photobacterium phosphoreum .Cresce  a  0-4°C, ma non cresce a 35 °C. E’ il microrganismo che emette più luce di tutti i batteri luminosi ed è la causa principale della luminosità degli alimenti ittici. E’ stato isolato da organi luminosi di pesci ed è un abitante comune delle acque marine.
Da quanto riportato si traggono le seguenti considerazioni:
-I batteri luminosi  rivelano la loro presenza sulla superficie degli alimenti ittici o nei terreni colturali quando questi substrati di crescita sono tenuti al buio ed a temperature ,meglio se comprese tra 15 C° e 30 °C.
-Il Photobacterium phosphoreum è la causa più comune della luminescenza dei prodotti della pesca trattati con sale e cotti.
 -I batteri luminosi sono organismi viventi comunemente nelle acque marine ed oceaniche e sono presenti normalmente sulla cute e nell’intestino di animali marini
-Alcune specie di fotobatteri sono localizzate in organi luminosi specializzati di pesci o di molluschi marini
-Quando i prodotti ittici diventano luminosi significa che sono presenti numerosi batteri luminosi indici di conservazione degli stessi alimenti a temperature e per tempi che hanno permesso il loro sviluppo ossia in condizioni di abuso di tempo/temperatura di conservazione
-La conservazione dei prodotti ittici cotti a 0°C  rallenta il loro sviluppo ed aumenta il tempo della loro conservabilità.
-E’ preferibile il consumo di questi alimenti nella stessa giornata o entro 2 giorni in quanto  la temperatura normale dei frigoriferi casalinghi né mediamente compresa tra i 5 e 6 gradi.
La produzione industriale dei prodotti ittici cotti indicati comprende diverse fase e,come avviene per tutte le  lavorazioni è necessario applicare nel processo produttivo un piano di autocontrollo per individuare i punti critici di contaminazione ed attuare le corrette procedure di lavorazione (GMP).
Le fasi produttive sono le seguenti:
1)ricezione dei gamberetti
2)eliminazione del ghiaccio di copertura e lavaggio
3)conservazione dei gamberetti liberati dal ghiaccio in cella frigorifera a  2°C
4)preparazione  (eliminazione del ghiaccio residuo e lavaggio)
5)cottura (CCP1)
6)raffreddamento e sgusciatura
7)pulitura
8)salatura e asciugatura (salamoia)(CCP2)
9) congelamento
10)ghiacciatura
11)gradazione  in base al peso e dimensioni
12)confezionamento
13)conservazione allo stato congelato
14)distribuzione
Nello schema di processo i punti critici sono individuati nella procedura di cottura e nel trattamento con salamoia per la salatura.
La cottura è il CCP più importante da controllare in quanto deve assicurare  la distruzione della maggior parte dei germi contaminanti eventualmente presenti come i patogeni (salmonella spp,vibrioni spp,Listeria spp) ed i contaminanti  (enterobatteri,enterococchi,Carnobacterium spp.,Vagococchi,Brochotrix thermosphacta, Psycrhobacte, Alteromonas, Achromobacter e Flavoacterium spp.)
Le specie di crostacei sottoposti a cottura mediante bollitura per almeno 6 minuti primi o più in base alle dimensioni del crostaceo (Pandalus, enaeus, Crangon Crangon e carne di granchio) in modo da raggiungere a cuore la temperatura di 79°C per3-8 secondi,così da assicurare la distruzione della maggior parte dei germi prima elencati.
Di solito sopravvivono al trattamento termico enterococchi e vagococchi.
Ovviamente possono  verificarsi contaminazioni prima del confezionamento per cui possono evitarsi applicando le norme  di comportamento igienico indicate per esempio nei piani di HACCP ritrovabili in linea intitolati “An illustrated exemple of HACCP plan.Wiley on linelibrery” e “Quality management programme based on HACCP in cooked shrimp process”
In fine, per evitare le contaminazioni post cottura è necessario procedure alla disinfezione delle superfici al trattamento ricorrendo con disinfettanti ossidanti, cioè con ipocloriti, acido per acetico e, soprattutto, con acqua ossigenata al 6% o con acqua ossigenata iperossigenata che assicura la distruzione non solo dei batteri ma anche dei loro biofilm.
 1 MV- Libero docente in Ispezione degli Alimenti di Origine Animale. Milano
2 MV- Spec. in Allev.Igiene Patol.Spec.Acquat.e Contr.Prod.Deriv. Milano

Microbiota delle chiocciole: i batteri e le muffe

Carlo Cantoni Libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale. Milano

Per uso alimentare nel mondo sono impiegate molte specie di chiocciole,In Italia quelle utilizzate

Come alimento sono l’Helix aspersa (petit gris,zigrinata),l’Helix pomatia ( romana o vignaiola),l’Eoba

nia vermiculata (vignaiola)-,l’Helix aperta,l’Helix lucorum (lumaca turca).L’Achatina fulica e altre specie

di  Achatina sono specie africane di grosse dimension

Altre specie edibili sono Il Corru aspersu,la Theba pisana,la Cepaea nemoralis,la Cepaea hortensis,l’Otala

punctata,l’Helix adanensis, (turca),la Cernella virgata e la Iberia adonensis  e la Otala lactea.

Produzione e lavorazione

Le Chiocciole sono ottenute da stagni,acquitrini,marcite o da allevamenti. Questi animali sono consumati

dopo cattura in acqua bollente e preparate secondo le ricette regionali. Chiocciole  tal quali o congelate

sono utilizzate come materia prima nell’industria alimentare per la produzione di  prodotti inscatolati.

Prima di essere avviate al consumo le chiocciole devono essere spurgate per eliminare i batteri presenti

e per togliere l’intestino.

Patogeni

Le chiocciole sono portatrici di molti parassiti come Clonorchis sinensis, Eshinostoma ilocanum, Fasciola

epatica, Fasciola gigantica , Fasciolopsis buski, Opisthorchis felineus , Paragonimus westermani.  e di batteri

patogeni

Germi delle superfici

Tra i batteri isolati dalle superfici delle chiocciole i germi,predominanti appartengono alla famiglia delle

Enterobacteriaceae e ai generi Citrobacter, Morganella, Klebsiella ed Enterobacter.

Citrobacter braaki,Citr.freundii e Citr.koseri sono le specie predominanti nelle chiocciole raccolte e

può isolarsi anche la Morganella morgani. Altre  Enterobacteriaceae isolate sono state identificate, preci-

samente : Enterobacter amninogenus, Enterobacter cloacae, Klebsiella  rhinoscleromatis, Klebsiella pneumo-

niae, Pantoea spp. Roaultella ornithinolytica, Proteus penneri, Escherichia coli, Hafnia alvei, Providencia

rettgeri ed Yersinia enterocolitica

Altri germi appartenenti alla famiglia delle Pseudomonadaceae sono stati:Pseudomonas alcaligenes, Pseudo-

monas putrefaciens, Pseudomonas mendocina, Pseudomoas putida e Pseudomonas pseudomallei.

Riguardo ai batteri Gram positivi,possono essere presenti  germi appartenenti allle famiglie delle

Listeriaceae, Aerococcaceae, Staphylococcaceae ed Enterococcaceae.

Tra le Listeriaceae, le specie più frequenti presenti sui gusci sono Listeria monocytogenes e L.innocua.

Una sola specie della famiglia delle Aerococcaceae è stata isolata: l’Areococcus viridans.

Della famiglia delle Staphylococcaceae sono risultate presenti Staphylococcus aureus, Staph.sciuri, e

Staph warneri

 Oltre ai batteri, sulle superfici dei gusci delle chiocciole sono presenti anche delle spore di miceti.

 appartenenti alle famiglie di microfunghi: Monialiaceae, Mucoraceae, e Dematiaceae.

I generi della famiglia delle Moniliaceae sono stati: Aspergillus, Chrysosporium e Fusarium.

Quelli appartenenti alla famiglia delle Mucoraceae identificate sono: Rhizopus  e Mucor

delle Dematediaceae è stato identificato  il solo generte Alternaria.

Quanto  al genere Fusarium è stata  identificata una sola  specie  il Fusarium oxisporum

Nel complesso il genere predominante è quello dell’Aspergellus, del quale sono state

identificate quattro specie:A.fumigatus, A.flavus e A.niger e A.terreum. La muffa più

presente è  risultata l ‘A.fumigatus

 Il numero delle spore  fungine presenti sui gusci si è dimostrato modesto, di circa 9  ufc/ cm²

 e di 4 ufc/ cm² nelle carni (Adegoke & coll 2010)

 Batteri nelle carni fresche

 

Riguardo alla presenza di batteri nelle carni  fresche  delle chiocciole sono stati isolati:Aeromonas hydrophila,Pseudomonas alcaligenes,Pseudomonas luteola, Pantoea agglomerans, Escherichia coli,

Enterobacter amnigenus e Listeria monocytogenes.

Nelle carni congelate sono risultati presenti i seguenti batteri:Enterobacter cloacae,Klebsiella oxytoca

Pantoea  spp., Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila,Staphylococcus sciuri,Staph.spp.Listeria monocytogenes,Lactobacillus spp,Bacillus subtilis e B.cereus

Assicurazione della qualità igienica delle carni di chiocciola

La salubrità igienica delle carni (piede) di chiocciola è ottenibile operando come  indicato di seguito:

1)controllo delle chiocciole vive al loro ricevimento

2)Loro lavaggio con acqua potabile

3)Trattamento con vapore a 105° C in tunnel

4)Calibrazione automatica delle chiocciole per mezzo di  vagli con fori di dimensioni stabilite

5)Rimozzione delle carni dai gusci e controllo (CCP1)

6)Primo trattamento in acqua a 100 C° per 1-5 minuti

7)Eviscerazione

8) Calibrazione automatica della carne con  vagli con fori di dimensioni stabilite

9)Secondo trattamento con acqua va 100 °C per 3-5 minuti. La temperatura interna delle carni

deve essere di 85 C° (CCP 2)

10)Confezionamento manuale

11)Congelamento a – 20 C°

12) Etichettatura

13Conservazione allo stato congelato

14)Distribuzione allo stato congelato (-20)

I punti critici per la igienicità della carne  dipendono dall’efficacia dei lavaggi e dei trattamenti

termici,dalla contaminazione dell’aria ambientale,dalle operazioni di confezionamento.(Temelli

& coll.2006)

Controllo igienico sanitario delle carni.

Rischi significativi sono nconseguentin alla presenza di:

-salmonelle

-shighelle

-VTEC

-parassiti

Misure di controllo

La contaminazione iniziale viene ridotta dalla spurgatura.

Le chiocciole devono essere cotte prima del consumo.

Se le chiocciole cotte devono venir rimesse nel guscio,questo deve essere riscaldato per eliminare

I batteri contaminanti

Chiocciole commercializzate in Italia

Sono prodotte e commercializzate: :

-Lumache (chiocciole) vive

-Lumache Rigatele

-Lumache Vignaiole Grandi

-Lumache di Vigna Helix  Aspersa

-Lumachine Theba Pisana

-Lumache Helix Aperta Opercolate

Chiocciole surgelate

-Lumache alla Borgognsa

-Carne di lumaca a carne chiara

-Carne di lumacaa carne lessata

-Carne di lumache Helix pomata

-Lumache vignaiole

-Lumache rigatelle

-Lumache in salsa con  verdure     

    

                                                          

Caratteristiche batteriologiche (esempi)

Carni surgelate

Conta mesofila totale                              UFC/g      < 30.000Co

Coliformi totali                                        UFC/g        <100

Escherichia coli                                        UFC/g        <5

Staphylococcus aureus                             UFC/g         <50

Listeria monocytogenes                               assente

Salmonella                                                   assente

Lumache vignaiole                     

Conta mesofita totale                                   UFC/g         <30.000

Coliformi totali                                            UFC/g         <100

Escherichia coli                                           UFC/g         <5

Staphylococcus aureus                                 UFC/g         <50

Listeria monocytogenes                               UFC/g          <11

Salmonella                                                    asssent

Disposizioni da Regolamento CE 853/2004.

Col termine lumache si  definiscono i gasteropodi terrestri delle specie Helix pomatia,Helix Aspersa Muller,

Helix lucorum e specie appartenenti alla famiglia Acatinidi.

Come da art.6 del Reg (CE) 853/2004,l’importazione di questi prodotti è consentita se sono rispettate le con-

dizioni sotto riportate :

-Provenienza da Paesi terzi autorizzati (Decisione 2003/812 CE

-Provenienza da stabilimenti figuranti in elenchi (ACCORDI BILATERALI)

-Presenza di certificati sanitari conformi ai modelli previsti(REG (CE) N.2074/2005)

Da sottolineare che l’armonizzazione non è completa per questi prodotti,perché gli elenchi di stabili-

Menti sono stilati su accordi bilaterali fra singoli Stati Membri e determinati  Paesi terzi.Questo determi-

na la  necessità che,prima di consentire l’introduzione di lumache preparate in altri Stati Membri,sia veri-

ficata l’autorizzazione dello stabilimento produttore  nello Stato Membro di destinazione. Deve essere

comunque verificata l’eventuale presenze  di allerta .

Stato batteriologico di lumache commercializzate in Italia

Premesso che le ricerche effettuate in  propositi e  anche i risultati ottenuti sono limitati,, Marangiu & coll (.

1993) hanno sottoposto ad analisi batteriologica esemplari di chiocciole non percolate ) provenienti dalla libe-  raccolta(240)esemplari,riscontrando nell 83% delle conte totali elevatissime (comprese tra 100.000 e

 10.000.0000 ufcc/g, E.coli e coliformi. Quest’ultimi in diversi soggetti superiori a 1.100 in Helix vermiculata.

Gli esemplari di H.aspersa sono risultati maggiormente contaminati rispetto a quelli di H.vermiculata e, in

Particolare le loro conte totali sono risultati comprese tra 100.000 e 10.000.000 ufc/g in un gruppo tra 100.000

ufc/g in un secondo. Complessivamente   per i coliformi le  loro quantità hanno oscillato da 13,4 ufc/ml a più

di 1.100 ufc/ml.In tutti i soggetti non si sono riscontrate salmonella e neppure Staph.aureus.

Iovino F & coll (2002) hanno ricercato le salmonella in 92  esemplari di lumache vive d’importazione

riscontrando la presenza di: S.abony,S.adelaide,S.durban,S.egusitoo.S.elomrane,S.newport,S. nigeria,

S.rhone,S.sheffield. Infine Tedde &coll (2009) hanno sottoposto ad analisi batteriologica 29 esemplari

di Helix aperta, H.aspersa ed H.vermiculata raccolte in natura rilevando la presenza di salmonella in un solo

esemplare.

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