BATTERI PRODUTTORI DI INDIGOIDINA

La indigoidina (5,5’-diamino- 4,4’-ldiidrossi-3,3’diazadifenochinone-2,2’) è un pigmento blu insolubile in acqua prodotto da alcuni batteri che impartisce alle  loro colonie il colore blu. Nei batteri è sintetizzato da un complesso enzimatico (polipeptidico sintasi) per mezzo del quale  la glutamina si ossida, eterociclizza e si dimezza. (Elazari-Volcani 1939, Starr,1958; Khuun & Coll.1960, Ensign & Coll. 1963;Starr & Coll. 1966; Knackmass & Coll.1969).La sua pro-duzione fenotipica è  tuttavia instabile perché può essere influenzata dalla composizione del terreno di crescita  ( Starr & Coll. 1966;  Chatterje & Coll. 1981) e dal funzionamento di geni specifici responsabili della sua produzione ( Reverchon & Coll.1994,2001). Di seguito si riportano brevi descrizioni  dei germi elaboratori del pigmento blu  e  i terreni utilizzati dai vari ricercatori  per evidenziare i germi produttori del pigmento intracellulare.

CLAVIBACTER MICHIGANENSIS subsp.INSIDIOSUS

Microrganismo patogeno per i vegetali (specialmente il pomodoro) il   C. michiganensis è un germe Gram positivo, capsulato, immobile, non formante catene. Fa parte del genere l Clavibacter, nel quale sono presenti altre 6 specie e 7 sottospecie. Il genere è compreso nella famiglia Actinomicetales, phylum Actinobacteria. Forma caratteristici granuli blu nei terreni di coltura contenenti ed elevate quantità di zuccheri utilizzabili in 7- 14 giorni. Per l’isolamento del microrganismo si può impiegare il terreno di King B addizionato  con 200  mg/L di cicloesimide (EPPO 2010) (1)o il terreno   con formula: mannitolo  g  2,5;estratto di lievito  g 1,K₂HPO g 0,1,KH₂PO 0,05 agar g 18  H₂0 1L. addizionato di mg 250 di actidione (2) o il terreno di Ftayeh  & Coll.2011) (3) lievito :mannitolo  g 2,5,estratto di lievito  g  2,K₂HPO₄,  g 005  NaCl,g 0,1 , MgSO₄.7H₂O,MnSO₄ .7 H₂O, FeS0₄   7H₂O g ,0015 ,H₃BO₃ 0,6,agar g 15 pH 7,0-7,1

DICKEYA DADANII

E’ una Enterobacteriacea patogeno per le piante (sopratutto pomodoro)  Appartiene  al gMnClenere Dickeya, famiglia Enterobacteriaceae, ordine  Enterobacteriales, phylum Gamma Proteobacteria. Il genere comprende 8 specie. Il   germe era conosciuto con il nome di Erwinia chrysantemi. Il microrganismo è un fitopatogeno produttore di indigoidina in elevata quantità (Che& Coll.2010) la  cui produzione si evidenzia coltivandolo sul terreno YDC agar  così costituito: 1%  estratto di lievito, 2 % glucosio,2% carbonato di calcio ;agar 1,5 %,H₂O L 1(Dye 1968).Due altri terreni  utili per l’isolamento sono stati proposti da Zee & Coll. (2006) denominati  NG e NG+ MgCl_{2 .}4H₂ 0, con le seguenti formule : 1)NG:Nutrientagar+CaCl₂.2H₂0,MgCl₂.6 H₂ e  MnCl₂.4 H₂0 rispettivamente alla concentrazione   finale di  NG Medium: g 23 di Nutrient agar,10%  gli-cerolo , mg 0,4 ₂ Mn Cl₂ (2mM) ,H₂0 1 L. ,pH 6,5. Sterilizzazione a 121 °C per 10 minuti  Il periodo di incubazione è di 2-4 giorni

PHAEOBACTER COERULEUS

E’ un microrganismo Gram negativo con flagelli polari, ossidasi e catalasi negativo. Cresce  formando colonie blu  sul terreno Marine agar Difco 2219.Appartiene al genere Phaeobacter , famiglia  Rhobacteriaceae, ordine Rhobacteriales, classe  Alphaproteobacteria,phylum  Proteobacteria. Nel genere sono presenti altre 5 specie (Vandecandelaere & Coll,2014 ).La composizione del Marine agar  è la seguente : peptone g 0,5 ; estratto di lievito g 1,0; citrato ferrico g 0,1; NaCl  g 19,45; cloruro di magnesio g 8.8;solfato di sodio g  3,24; calcio cloruro g 1,8 ;cloruro di potassio g 0,55;bicarbonato di sodio g 0,16 ; bromuro di potassio  g 0,08; cloruro di stronzio g 0,034; acido borico g 0, 022; silicato di sodio g 0,004; fluoruro di sodio g 0,0024 ; nitrato d’ammonio  g 0, 0016; fosfato disodico 0,008;agar  g 15 ;  acqua distillata ml 1.000

PSEUDOMONAS  FLUORESCENS

Le Pseudomonas  fluorescens  sono batteri Gram negativi, ossidasi positvi facenti parte  del genere Pseudomonas, famiglia Pseudomonadaceae, ordine Pseudomonadales, classe Gamma Proteobacteria, divisione Gracilicutes, Regno Procariota. Nel genere sono presenti 213 specie. P seudomonas fluorescens è un germe aerobio obbligato presente in  diversi habitat come le piante, il suolo e le acque. Il nome deriva dal pigmento verde fluorescente denominato pioverdina. I ceppi della specie sono mobili per mezzo di molteplici flagelli polari. Elaborano  sideofori siderocromici per procurarsi il Ferro necessario per la loro crescita. Diversi ceppi sono usati in agricoltura per le loro proprietà anti-batteriche , antifungine e antitossine. Sono anche in grado di distruggere contaminanti chimici come idrocarburi policiclici aromatici, stirene, TNT e idrocarburi. Il genere Pseudomonas è composto da numerose specie di pseudomonas e in base alla  determinazione dei caratteri fenotipicii  di 305 ceppi di Pseudomonas Molin & Coll. (1986) hanno individuato  4 gruppi (clusters) di Pseudomonas fluorescens  precisamente : P.fuorescens biovar 1(I), biovar 2 (II), biovar 3(III), biovar 4(IV) ai quali è stato poi aggiunto il biovar V. Questa  suddivisione tassonomica resta ancora quella di identificazione più rispondente ai fini pratici rispetto a quelle  basate sul sequenziamento di  di frazioni del DNA pubblicate  da  Moore 1996),Anzi &  Coll. (2000).Yamamoto & coll. (2000) e da Mulet & coll.(2010). Le quali pur essendo di elevato  contenuto scientifico non hanno   sequenziato il DNA e  altri geni di  Pseudomonas lemonnieri, produttore di pigmento blu  classificato come biovariante IV da Molin & Coll,(1986). Poichè questo ceppo si è reso responsabile di chiazzature blu di alimenti di origine animali (formaggi tipo mozzarelle, prodotti  di salumeria e di carni fresche), si è ritenuto utile riportare la cronologia degli eventi oltre alla indicazione dei terreni  di coltura utilizzabili per il suo isolamento. La  prima segnalazione di mozzarelle chiazzate di blu   è stata segnalata  nei  2000  (Cantoni & Coll. 2000, )  ,e altra  sono state segnalate in anni successivi  (Cantoni & Coll.2003;2006).Oltre alle mozzarelle  , chiazzature blu si sono verificate anche a danno di tagli di carne fresca suina, di prosciutti freschi destinati alla cottura e di carcasse di conigli ( Cantoni & Coll.(2008). La formazione del  p biovar da parte di Molin & Coll (1986)  si basò sulla determinazione dei caratteri fenotipici di 16 ceppi ,dei quali 2 denominati P.lemonnnieri provenienti da due ceppi provenienti da due ceppoteche nazionali e dall’analisi di 14 ceppi produttori di pigmento blu. Identificato da da Kun & Coll,Starr&Coll. (1966) e Starr (1967), P.lemonnieri è stato isolato e descritto  nel 1913 da Lasseur .In un primo tempo la sua posizione tasson omica fu discussa da Hugo & Coll. (1957) e da Starr &Coll.(1960) poi Steiner & Coll. posizionaro il microrganismo  come biotipo F di Pseudomonas fluorescens, a sua volta poi identificato nel biovar IV da Molin & Coll. (1986).Oltre va Hugo &  Coll. (1956)né stato isolato dal suolo da  Veron & Coll.(1968),da  Skvortsova & Coll. (1979),da Matei & Coll. (2006). Il pigmento blu  fu identificato come indigoidina da Starr & coll.(1967 ). Dagli alimenti con chiazzature blu,è stato costantemente isolato un altra specie di Pseudomonas identificato come P.libanensis (Daboussi & Coll.(1999),una nuova specie isolata dalle acque  nel Li produttrice di un pigmento fenazinico verde scuro solubile  in acqua,i dentificato come PCA o fenazina-1-acido carbossilico (Saini & Coll.2008). A partire dal 2010 nel nostro paese si  sono verificati numerosi casi di colorazioni blu in mozzarella  dai campioni esaminati si sono isolati  pulso tipi responsabili della colorazione  blu impartita  dal pigmento insolubile blu ( Martin & Coll. 2011,Nogarol & Coll.2013;Andreani & Coll.2014).Infine Caputo & Coll. (2015)hanno identificato il pigmento prodotto dai  ceppi come  indigoidina riconfermando la identificazione precedentemente riportata dai ricercatori citati precedentemente. Per il controllo sistematico delle produzioni necessario per escludere la presenza nelle acque e nei liquidi di governo  si deve disporre di terreni colturali solidi atti ad evidenziare la eventuale del microrganismo in grado di garantire la produzione dl pigmento blu .In proposito sono stati proposti i seguenti terreni: 1) YDC agar contenente : estratto di lievito Difco 1%,glucosio 2%, , carbonato di calcio purificato 2%, agar Difco1,5 %.Acqua 100 ml.(Starr & Coll.(1967),2) terreno di Xinhiu & Coll.: triptonem8-12 g, estratto di lievito 4-6 g., acqua ml 1.000,agar 18   g..3)R2A Reasoner & Coll.(1985):  0,5 estratto di lievito, g 0,5 Difco  proteose peptone no 3 Difco,g 0,5 Casamino Acids (Difco), g 0,5 glucosio, g 0,5 amido solubile ,g  0,3 K₂ HPO₄,g 0.05 Mg SO₄.7H₂O, g 0,3 sodio piruvato, g 15 , H₂O distillata, ph 7. 4) Potato destrose agar :g 4 di estratto di patata, g 20 destrosio, g 15 agar, acqua 1000 ml. 5) Mascarpone  agar:   g 500  mascarpone, g 5 estratto di lievito, g 20   destrosio, g 18 agar, acqua distillata l 1.000 (Cantoni & Coll.2000)

SHEWANELLA VIOLACEA

E’ un batterio Gram  negativo, ossidasi  positivo, aerobio. anaerobio facoltativo eterotrofo, mobile con un flagello polare. Appartiene al genere  Shewanella, famiglia Shewanellaceae, ordine Alteromonadales, classe  Gamma Proteobacteria. Il ceppo produce  pigmento indigoidina sul   terreno Marine broth 2216 Difco così modificato ;Terreno MB + g 0,5 %  estratto di lievito, 0,2 % Casaminoacid Acid + agar g 1,5 %.(Kobayashi & Cll.(2007).

SINOMONAS  ATROCYANEA (già Arthrobacter atrocyanea)

Le cellule microbiche sono Gram variabili e la loro morfologia muta da cocco a bastoncino. Sono aerobie e mesofile. Producono indigoidi-na crescendo sul terreno YDC  incubato a 30° C con formula : g  20 di carbonato di calcio sminuzzato finemente, g 20 glucosio, agar  g 15 o 18.H₂O  1L . Appartiene  al genere Sinomonas con altre  50 specie.Il genere fa parte della famiglia  Micrococcaceae, ordine Actinomycetales, sottoclasse  Actinobacteridae, classe Actinobacteria, phylum Actinobacteria. (Zhou & Coll.2009).

VOGESELLA INDIGOFERA

Il  batterio è un aerobio Gram negativo produttore di indigoidina .Appartiene al genere  Vogesella con altre 5 specie ( Grimes  & Coll.1997)Il genere fa parte della famiglia delle Neisseriaceae,ordine Neisseriales,classe Beta  Proteobacteria, phylum  Proteobacteria. Il germe è mobile  con flagello polare e con forma di bastoncino. Si presenta solo, appaiato in corta catena, occasionalmente con forma vibroide .Le colonie si sviluppano su terreno PCA dapprima con colorazione gialla che vira al blu dopo 24 -48 he il pigmento è appunto indgoidina ( C₁₀ H₈ N₄O₄ o 5,5^ì-diamino-4,4^’ – diidrossi -3,3^’-diazadifenochinone-2,2^’.

Conclusioni

Come  è stato segnalato in precedenza la difficoltà dell’isolamento dei batteri produttori di indigoidina è rappresentato dalla mancanza di un terreno di uso comune sul quale i batteri possano sintetizzare il pigmento e rendersi cosi  rapidamente identificabili. Nel  settore lattiero caseario si usa il mascarpone agar  che  consente  lo sviluppo di colonie di Pseudonas specie produttrici sia di indigoidina che di fenazine. Sarebbe  interessante valutare anche il comportamento del terreno Marine agar come tale o addizionato di glutammina che dovrebbe favorire la formazione del pigmento blu dei ceppi biovar IV- La messa a punto di un terreno rispondente a questo scopo è di fondamentale importanza per conoscere la presenza del microrganismo nelle acque e nei liquidi di governo per la prevenzione della  contaminazione.

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LAB ETEROFERMENTANTI E ALTERAZIONE CROMATICHE DI PRODOTTI DI SALUMERIA

Prof. Carlo Cantoni, libero docente in Ispezione degli alimenti di Origine Animale,Milano

Stefano Ibba ,medico veterinario Milano

I  batteri lattici (LAB) sono ampiamenti diffusi in natura e sono mi  presenti negli m ambienti di lavorazione delle carni e nei  prodotti di salumeria. In questi si trovano lattici omofermentanti  ed eterofermentanti. Questi  microrganismi appartengono  ai generi  Carnobacterium, Lactobacillus,, Leuconostoc, e Weissella. I LAB omofer-mentanti producono dalla fermentazione degli zuccheri presenti quasi esclusiva   -mente acido lattico   mentre le specie etero fermentanti producono quantità  considerevoli di   metaboliti non desiderabili per i prodotti di salumeria come CO₂ ertanolo, acido acetico, acido butanoico, acetoina e perossido d’idrogeno, mucosita e  talvolta si rendono responsabili di alterazioni cromatiche avvertibili come chiazzature bianche ed inverdimenti dei prodotti di salumeria nei quali sono presenti. (  Niven & Coll. 1949; Niven,1951; Evans1951;Niven 1957;Egan 1983;Bjor-kroth & Coll. 1996;IIshola &Coll.2012). Mentre nei prodotti crudi fermentati prevalgono i lattobacilli omofermentanti (Lb.sake Lb.curvatus) nei prodotti cotti (wurstel, bologna , prosciutti) possono,talvolta, prevalere  ceppi di Leuconostoc carnosum, leuconostoc menteroides var.mesenteroides, Leuconstoc gelididum Weissella viridescens, Lattobacilli eterofermentanti, Carnobacterium maltoaroma- ticum, Carnobacterium gelidum (Krockel 2013). Si è ritenuto, quindi opportuno  descrivere in dettaglio le alterazioni cromatiche provocata dai LAB eterofermentanti a danno di prodotti di salumeria.

Alterazioni cromatiche.

Le alterazioni dei prodotti di salumeria provocate da LAB etero fermentanti sono riconducibili alla formazione di macchie bianche  formatosi  nel tessuto muscolare all’interno delle bresaole e all’inverdimento superficiale di prodotti cotti (Niven  &  Coll. 1949). Nel primo caso ceppi di lattobacilli eterofermentanti  sono ritenuti responsabili del difetto(anche se  non sin può escludere anche l’attività piu ridotta di lattici omofermentanti che possono  produrre perossido d’idrogeno in assenza di zuccheri nel substrato dopo averli metabolizzati) e. per gli inverdimenti sono stai identificati come responsabili anche ceppi di Weissella viridescens. In genere la contaminazione dei prodotti di salumeria da LAB eterofermentanti è dovuta a scadenti condizioni igieniche di locali e delle attrezzature di lavorazione,specialmente delle linee di lavorazione. In tali condizioni sembra che i LAB etero fermentanti trovino  buone condizioni di sopravvivenza e di moltiplicazione con produzione di biofilms, proprietà accertata da Isola (2012)per Lb.fermentum.Lb.brevis., Lb.cellobiosus,  Leuconostoc mesenteroides. Per i prodotti carnei a taglio singolo come le bresaole, le fonti di contaminazioni  conseguono, di solito,all’uso di saline contaminate  o riusate o di vecchia preparazione, mentre per i prodotti cotti (prosciutti cotti,spalle cotte,wurstel la contaminazione proviene dalle linee di lavorazione dopo  la cottura durante le manipolazioni precedenti in confezionamento in involucri plastici. La formazione delle macchie bianche, delle quali si allega una foto dimostrativa,è dovuta all’azione ossidante del perossido di idrogeno sul pigmento muscolare nitrosomioglobina   con inibizione  dell’attività catalasica del pigmento muscolare, nel caso dell’inverdimento  il perossido d’idrogeno elaborato dai LAB  denaturando il nitromiocromogeno lo trasforma in coleglobina.

LACTOBACILLUS

I lattobacilli  sono batteri Gram positivi con forma di bastocino appartenenti al genere Lactobacillus della famiglia  delle Lactobacillaceae.Le prime segnalazioni della presenza nociva di Lattobacilli  etero fermentanNiven $i  devono a Niven & Coll,1949,Niven (1951),Niven & Coll.1957).Questi  ricercatori ritennero responsabile dell’inverdimento superficiale di salsicce un ceppo di lattobacillo identificandolo come Lb  viridiscens ( oggi Weissella viridiscens).Di questo ceppo batterico si occuparono Evans & Coll.(1951) I quali chiarirono le sue  esigenze nutritive  formulando un terreno favorevole alla sua crescita e a quelle di altri LAB etero fermentanti.Nel 1964 Whittenburg  studiò la  formazione di perossido d’idrogeno da parte di in certo numero  di ceppi verificando l’effettiva produzione del perossido da parte di Lb..brevis,  Lb.plantarum, Lb.casei(?) . Nel 1963 d’Aubert individuò  la reazione biochimica di formazione del perossido d’idrogeno nei lattobacilli eterofermentanti. Ciò premesso, le specie di Lattobacilli rinvenibili più di sovente nei prodotti di salumeria sono: L.bifermentams, Lb. brevis,  Lb.buchneri, Lb.cellobiosus, Lb collinoides, L. di produzione del perossido da parte deimlattici etero fermentanti, certi ceppi di Lb.fermentum sono risultati i maggiori  produttori con la elaborazione  di perossido d’idrogeno fino  a O,35 mg/L ,mentre quella dei restanti ceppi è  stata molto inferiore  ( Lang & Coll.2005;Ishoba & Coll.2012).

CARNOBACTERIUM

E’un  genere comprendente 12 specie  specie di batteri Gram positivi con forma bastoncellare appartenenti al genere Carnobacterium  della famiglia delle Leuconostocaceae. Tutte le specie producono perossido d’idrogeno, ma solo Cb.divergens e Cb. viridans hanno causato l’inverdimento superficiale di prosciutti confezionati dopo la loro esposizione all’aria Holley & Coll.2002)

LEUCONOSTOC

E’ un genere comprendente batteri  Gram positivi della famiglia Leucono-stocaceae. Hanno forma   bastoncellare e formano catene. Del genere fanno parte 23  specie e 7 sottospecie. Tra queste Leuc.mesenteroides e Leuc.gelidum hanno provocato inverdimenti superficiali di prosciutti cotti. La formazione di perossido d’idrogeno da parte di questi microrganismi si verifica in presenza di ossigeno  si manifesta  dopo l’apertura delle confezioni  di prodotti cotti (prosciutti).

WEISSELLA

Le Weissellae  sono  batteri Gram positivi appartenenti al  genere Weissella della famiglia  delle Leuconostocaceae. Si presentano con forma  di bastoncino  corto irregolare con estremità arrotondate o con forme coccica e ovoidale, formanti cate-ne brevi. Nel genere sono comprese 19 specie. Di queste, Weissella viridescens  ha provocato l’inverdimento di prodotti cotti di salumeria per la sua notevole produzione di perossido d’idrogeno  che ossida il pigmento della carne salmistrata   cotta, il nitrosomiocromogeno. Anche in questo caso la decolorazione si evidenzia dopo l’apertura del prodotto a contatto con l’ossigeno dell’aria. Inoltre Weissella viridescens ha provocato l’inverdimento dell’interno della massa muscolare di lonza l’accumulo di perossido d’idrogeno prodotto dal microrganismo.

Terreni colturali per il conteggio e il riconoscimento dei  LAB etero fermentanti produttori di perossido d’idrogeno (H₂0₂₎) .

Il primo terreno utilizzato per il riconoscimento dei batteri produttori di  perossido d’idrogeno è stato il “Pirosolite agar”  descritto da Knetema (1947)  modificato  e poi sostituto con un terreno messo a punto da  Whittembury (1964) contenente ossido di manganese denominato MDO agar. Ambedue i terreni  consentivano il riconoscimento dei batteri produttori mediante la comparsa di aloni di chiarificazione  formatisi intorno alle colonie. Oltre a questi terreni lo stesso Whittembury  propose un nuovo terreno che consentiva un loro riconoscimento più facile denominato HBD a base di sangue bovino cotto+ o dianisidina , la cui formula è la seguente:terreno agar nutritivo  di base(90 ml,pH 6,5) con aggiunta di di ml 5 di una miscela di sangue bovino defibrinato ed acqua il tutto riscaldato a 100 °C per 15 minuti,A questo terreno tenuto a 48°C viene aggiunta la o  dianisidina  (g 0,1  in ml 5  di acqua distillata trattata a 100 °C per 15 minuti). Infine al tutto è aggiunto il carboidrato  in concentrazione dell’1% (p/v). La produzione del perossido è indicata dalla crescita della colonia batterica circondata da un alone decisamente nero,nettamente distinguibile dal colore scuro del terreno di crescita dovuto  all’ossidazione dell’o dianisidina per azione del perossido batterico  terreni identificativi più rispondenti sono  i cromogeni utilizzati da Schellenberg &coll. (2012) e da Saito coll. (2007) utilizzato da Krockel(2011) per isolare i ceppi batterici eterofermentanti nei prodotti carnei. I terreni utilizzati da Scellenberg & coll (2013) sono i seguenti :1) RH Rogosa medium contenente per litro:1,mg l 1 % p/v di per ossidasi di rafano (Sigma),mg 250 di tetrametilbenzidina (TMB Sigma)per la evidenziaione cromo genica di  H₂O₂. 2) di  medium (componenti per litro): g 41 di Brucella agar (EMD),g 20 di amido solubile,g 0,86  di magnesio solfato anidro (Sigma),g  0,18 di solfato di manganese  monoidrato  (Sigma), ml 1  d ella soluzione di emina al 5% (p/v) (Sigma) disciolta in 1N NaOH,ml 2,5 di una soluzione  al 5 % p/v di vitamina K  disciolta in ETOH al 95% e  ml 50 di siero di cavallo (Sigma) + il reagente cromogeno indicato nel terreno  precedente. Un terreno con formulazione più semplice è stato formulato da Saito & Coll (2007) : 1 g/L di FeCl₂ .6 H₂O; g 1,0/L  di potassio esacianoferrato(III) conosciuto anche come potassio ferrocianuro , g 37di BHI brodo, g 15/L di agar. Il terreno va preparato come indicato nel lavoro Saito & Coll. 

CONCLUSIONI

La determinazione della presenza  di LAB etero fermentanti è utile per la ricerca di LAB nelle saline e per verificare la presenza di questi microrganismi nei prodotti inverditi o per individuare le fonti di contaminazione e l’efficacia dei processi sanificanti. Tra ni terreni indicati il terzo .denominato blu di  Prussia, secondo Krockel (2011) si è rivelato particolarmente adatto e  di preparazione più semplice.

RIASSUNTO

Nel testo sono descritti i LAB etero fermentanti che formano macchie bianche e inverdimenti nei prodotti carnei di salumeria. Sono altresì riportati i terreni colturali utili per la loro identificazione.

SUMMARY

Heterofermentative LAB and discoloration of meat products

In the text heterofermentative LAB forming white spots and greening in meat products are described. The culture media useful for their identification are, also, reported.  

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BIOFILMS NELL’INDUSTRIA DELLA CARNE

Carlo Cantoni. Libero docente  di  Ispezione degli alimenti di origine animale. Milano Stefano Ibba. Medico Veterinario, Milano

I biofilms come si presentano in natura consistono principalmente di microrganismi vitali e non vitali  inglobati in sostanze  polianioniche  polimeriche extracellulari adese ad una superficie solida (Chmelewski & coll. 2003). Le sostanze polimeriche extracellulari  sono formate da polisaccaridi, proteine, fosolipidi, acidi tecoici, e nucleici e altre sostanze polimeriche e con  80-85% di umidità. Le EPS svolgono un’azione protettiva ai microrganismi presenti nel biofilm fornendo nutrienti e impedendo l’accesso di biocidi, metalli, tossine e impedendo l’essiccamento. I biolfilms dell’industria alimentare possono contenere  residui e minerali  derivanti dal tipo di  alimento lavorato  e dall’acqua utilizzata. I biofilms possono avere un elevato livello  di  organizzazione poiché possono essere  presenti in comunità formate da singole o più specie batteriche fornendo loro uno strato singolo o una struttura tridimensionale oppure possono formare  aggregati a forma  di fiocco o di granulo

Formazione del biofilm.

 I batteri  presenti nelle superfici di lavorazione delle industrie  della carne possono svilupparsi formando biofilms. Questi ambienti presentano una varietà di condizioni tali da favorire la  loro formazione per la esistenza di nutrienti, umidità e presenza di microrganismi sulla superfici delle carni. Cosi il biofilm, dopo la sua formazione, costituisce una fonte una potenziale fonte di  contaminazione degli alimenti che può esitare  nella loro alterazione o nella trasmissione di germi patogeni. Inoltre, quando un biofilm si distacca dalla superficie abiotica, i singoli microrganismi possono diffondersi.

I batteri formanti biofilms sono stati Salmonella spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Campylobacte spp., Escherichia coli, E.coli STEC, Listeria spp., Staph.aureus.

Formazione di biofilm.

La colonizzazione batterica di una superficie solida  è un processo polibasico che coinvolge fattori fisico chimici e biologici. La formazione del biofilm avviene in 5 fasi: 1) una iniziale adesione del microrganismo platonico alla superfice solida.

2) La transazione da reversibile alla adesione irreversibile del microrganismo in seguito alla sua produzione di polimeri extracellulari da parte del microrganismo.

3) primo preliminare sviluppo della struttura del biofilm.

4) sviluppo di microcolonie  nel biofilm maturo.

5) dispersione dei microrganismi dal biofilm nell’ambiente circostante.

In dettaglio, il processo avviene così:

Il primo evento è  costituito dall’assorbimento di molecole organiche ed inorganiche sulla superficie solida. Ciò determina la formazione di un substrato condizionanti la presenza del microrganismo, o primer batterico, che favorisce la capacità del batterio ad aderire a questo substrato. In particolare le proteine spesso formano substrati che favoriscono l’adesione batterica. Nella produzione di alimenti si riscontra con maggiore frequenza la formazione di biofilms in presenza di una elevata concentrazione di proteine. Ad esempio le proteine del siero di latte sono prevalenti negli impianti di lavorazione del latte ed è stato dimostrato che aumentano l’adesione batterica aumentando anche l’adesione dei batteri lattici. 

Dopo  che si è formato il primo strato condizionante la adesione batterica procede. I fattori e i procedimenti di lavorazioni favorenti l’aumento dell’adesione batterica sono  i valori estremi alti o bassi di pH e le elevate temperature di contatto delle superfici di lavorazione, che entrambi denaturano le proteine facilitando la formazione degli strati condizionatori. Inoltre lenti flussi di liquidi sopra il biofilm aumenta il tempo di contatto con i nutrienti presenti nello stesso. Altri fattori sono la disponibilità di nutrienti, che è ubiquitaria negli impianti di  produzione di alimenti, la durata del tempo di contatto del batterio con la superficie, a fase di  crescita del  germe e la idrofobicità del substrato. Interessante è sapere che la vitalità della cellula batterica ha una importanza limitata sulla propensione all’adesività. Le cellule batteriche vive o morte aderiscono alle superfici con la stessa  propensione. L’adesione batterica è mediata dalle fimbrie, pili, curli, fagelli, tutte appendici che si estendono all’esterno della cellula. L’adesione batterica è anche rafforzata dai polisaccaridi extracellulari che formano un ponte tra i batteri e lo strato  condizionatorio. Il ponte è una combinazione di  legami idrogeno, ionici, covalenti, di forze elettrostatiche, forze di Van der Walls e interazioni idrofobico, interazioni dipolo-dipolo. Inizialmente, i legami tra i batteri e lo strato condizionatore ma non sono tenaci e possono essere rimossi dal  lavaggio. Tuttavia, col tempo, questi legami sono rafforzati rendendo l’adesione a contatto irreversibile.

Una volta inglobati entro il biofilm e cellule lesionate o insufficientemente  sviluppate per mancanza di nutrienti hanno la opportunità di ripararsi, di metabolizzare i nutrienti  presenti nello spazio condizionato, di crescere e di riprodursi. Continuando a  moltiplicarsi i copiosi volumi di polisaccaridi extracellulari prodotti assicura una barriera protettiva intorno alle cellule. Le materia inorganica ed organica che giunge  a contatto col biofilm vengono assorbite aumentando le dimensioni del biofilm e rifornendo  ulteriore nutrimento. I biofilms si sviluppano  rapidamente quando vi è una fonte continua di nutrimento. In tali condizioni, un biofilm può considerarsi “maturo” entro 24  ore e può continuare ad aumentare in dimensioni millimetriche in pochi giorni. Lo sviluppo di un biofilm può avvenire entro 1 ora  con  il 10% di  popolazione batterica  aderente irreversibilmente allo strato condizionatorio. Dopo 8 ore di produzione più del 91% di batteri sono adesi irreversibilmente. 

Come il biofilm matura, aumenta la resistenza contro vari disinfettanti probabilmente per la produzione di polisaccaridi extracellulari. La rimozione del biofilm durante le operazioni di sanificazione routinarie diventa un compito difficile da realizzare perché l’aumento del tempo di contatto col sanitizzante e quello dell’attività meccanica necessaria richiedono maggior costo del personale e un tempo più lungo per la rimozione.

Presenza di biofilms  nelle strutture di lavorazione e produzione degli alimenti.

Biofilms sono rinvenibili non solo sulle superfici di lavorazione ma anche sulle superfici di prodotti, specialmente vegetali. Le superfici delle strutture sono costituite da acciaio inossidabile, alluminio, vetro, guarnizioni di Teflon e possono supportare biofilms. Le superfici degli ambienti di lavorazione possono essere contaminate per via aerea, dal personale e dalle operazioni di pulizia. Biofilms sono stati riscontrati su superfici a contatto con alimenti come guarnizioni, nastri trasportatori, pastorizzatori e in attrezzature con fessure e spazi morti. Queste zone spesso sono difficili da raggiungere durante la pulizia e la sanificazione creandosi così  delle condizioni ideali per lo sviluppo di biofilms. Anche le superfici corrose, rotte, fessurate trattengono particelle  di  cibo e costituiscono siti ideali  per permettere la formazione di biofilm. (Sofos 2009).

Biofilm nell’industria della carne.

Durante le fasi di abbattimento dell’animale, le carcasse possono essere contaminate da batteri provenienti da diverse fonti quali le feci, la pelle, il tratto gastrointestinale, i linfonodi, l’aria, l’essere umano. Lo scuoiamento e l’eviscerazione potenzialmente causano  la dispersione di microrganismi conseguentemente le superfici di lavorazione della carne e le attrezzature presenti nell’ambiente  possono venire contaminate dalla carcassa, dagli ingredienti, dall’acqua da roditori e da insetti. Sulla superficie della carne si sviluppano batteri durante la refrigerazione con variazioni della popolazione batterica  tra quella della carne e  quella delle attrezzature. 

I batteri presenti possono essere non patogeni e patogeni. 

I principali generi isolati da carni bovine sono: Pseudomonas, Staphylococcus, Enterobacter, Flavobacterium, Klu-viera, Moraxella, MicroGram negativicoccus, Bacilus, Kocuria, Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Brochotrix, Gemella, Proteus, Corynebacterium , Erysipelotrix, Kurthia, Enterococcus. In generale i batteri Gram negativi formano più biofilms rispetto ai Gram positivi compresa L.monocytogenes. La formazione più elevata di biofilms è stata osservata  per Acinetobacter, Citrobacter e Pseudomonas. Gli Enterobacter formano poco biofilm paragonato a quelli degli altri enterobatteri.

Batteri non patogeni. 

Pseudomonas è il genere più presente e le Pseudomonadaceae sono  pure i principali alteranti le carni. La contaminazione di queste durante la lavorazione proviene dall’acqua, le mani, e i materiali. Vi sono prove che le Pseudomonas spp presenti sulle superfici dei tavoli di lavorazione possono colonizzare le superfici inferiori delle canaline e dei tubi di acqua delle stanze di lavorazione. I microrganismi sono trasportati per via aerea da aerosols prodotti durante la pulizia dei tombini e degli ugelli  dei depuratori. Il biofilm delle Pseudomonas spp è composto da t polisaccaridi (levano, alginato Pel, cellulosio), DNA, proteine, materiale proteico non definito, Rhamnolipidi, pili  di tipo IV (TAP) e flagelli.

Batteri patogeni. 

Salmonella. Diverse ricerche hanno dimostrato la capacità  di ceppi di Salmonella di formare biofilms su varie superfici abiotiche come  plastica, (politilene polistirene), gomma, cemento, acciaio inossidabile che possono trovarsi comunemente nelle fattorie, macelli, abitazioni, industrie di lavorazione delle carni, cucine, toilette e bagni. Salmonelle possono formare biofilms anche su vegetali (alfa alfa, lattughe). Inoltre le salmonelle sono capaci di aderire e di formare comunità batteriche, microcolonie e anche biofilms maturi sulle cellule vegetali e animali. I biofilms sono composti da  esolipolisaccaridi, polisaccaridi (cellulosa, acidi colanici, antigene capsulare o anionico) e da materiale proteico costituito da fimbrie tipo 1 (Pef), fimbrie curli (Csg), fimbrie polari (Lpf fimbrie aggregative (Tafi o agf), da fattori di  colonizzazione (Bcf ee Sth) e da flagelli. 

Escherichia coli produttori di tossina Shiga. La specie Escherichia coli comprende  ceppi membri della normale  popolazione commensale degli esseri umani ed animali e ceppi patogeni per  gli stessi soggetti citati. 

I ceppi patogeni fanno  parte di due gruppi:  gli E.coli intestinali (InPEC) e gli E.coli extraintestinali (ExPEC). Questo  secondo gruppo è responsabile di infezioni del tratto urinario (UPEC), di sepsi neonatali e di anziani, di meningiti, e di varie  malattie infettive animali incluse le mastiti. Gli inPEC sono classicamente divisi in 8 sottogruppi  in base alle malattie provocate,i loro fattori di virulenza e la loro filogenesi. 

Gli 8 patotipi sono: gli E.coli aderenti-invasivi (AIEC) associati con la malattia di Crohn, gli E.coli  diffusamente aderenti (DAEC), gli E.coli enteroaggregativi (EAEC), gli E,coli enterossigeni (ETEC), gli E.coli enteropatogeni (EPEC), gli E.coli produttori di tossina  Shiga (STEC) che comprendono i ceppi enteroemorragici E.coli (EHEC) e gli E.coli enteroinvasivi (EIEC) che comprendono anche la Shigella. 

I ceppi STEC sono diffusi in tutto il mondo nelle acque e sono patogeni alimentari. 

I bovini sono un importante  serbatoio di STEC e in questa specie colonizzano asintomaticamente; possono essere presenti in nelle feci di pecore, capre, tacchini e suini. Gli episodi delle malattie da STEC sono tipicamente associate a carni bovine contaminate: tuttavia il latte non pastorizzato, l’acqua contaminata, le verdure fresche e certi frutti contaminati e succhi di sidro si sono rese responsabili di malattia. Gli STEC  possono persistere per parecchio tempo nell’ambiente esterno, nelle acque e nel terreno. I ceppi EHEC sopravvivono per più di 8 mesi nell’acqua contaminata da feci bovine. Gli STEC sono anche una delle principali preoccupazioni negli impianti durante la lavorazione delle carni e la contaminazione delle carcasse con STEC può  verificarsi nelle fasi di macellazione, scuoiamento e taglio. Pertanto popolazioni di STEC sono rinvenibili sulle superfici della varie attrezzature impiegate e possono diventare fonti di ulteriori contaminazione dei tagli carnei. La presenza di STEC nei bovini e negli impianti di lavorazione è ben documentata ed è stato ipotizzato che la loro capacità di formare  biofilms su differenti superfici sia responsabile della distribuzione e della persistenza di STEC negli stabilimenti di produzione della carne.

Diversità genetica dei ceppi STEC.   

Il sierotipo  STEC predominante  più noto associato con episodi di malattia è  lo O157:H7. Questo è uno dei primi sierotipi identificato quale causa della sindrome uremica (HUS). Tuttavia altri sierotipi clinicamente importanti sono stati identificati: O26, O45, O103, O111 e O145. Altri   sierotipi  (O113:H21 e O91:H21) in genere causano sporadici casi di  HUS. Un altro sierotipo  responsabile di numero avvenuti  casi in Germania nel 2011 è il sierotipo O104:H4. Il microrganismo è un tipico EAEC  con presenza del gene, trasportato per via orizzontale da un batteriofago, stex2  responsabile della  produzione della tossina (STEAEC).   

Nella formazione dei biofilms intervengono  vari fattori;

1) Nella prima fase di contatto con le superfici (Primo contatto) : la  mobilità dei flagelli; la superficie di adesione, (rogosità, idrofobicità), il tipo di substrato,la temperatura,il pH,le forze ioniche;

2). Nella fase di attacco: le adesine fimbriali: tipo 1; curli, pili tipo 4. Fibre lunghe polari, fimbrie F9, capsula, LPS, proteine;

3)Nella fase di maturazione: gli autotrasportatori (adesine),EPS, PGA, cellulosa acido colanico, capsula, LPS, QS e proteine.

4) La fase finale è la dispersione del biofilm ma le cause per ora sono sconosciute.La matrice del biofilm di E.coli  ,quindi,formata da 3 differenti EPS: la poli-N-acetilglucosamina, (PGA), l’acido colanico e/o  cellulosa e LPS..Negli ambienti di lavorazione delle carni gli STEC aderiscono  alle superfici di acciaio inox,di polistirene,di vetro, di poliuretano, di polietilene ad alta densità. (Vogeler & coll.(20014).

Caratteristiche del biofilm.   

E.coli O157:H7 rimane per 4 giorni sulle superfici  di acciaio inox insieme agli acidi organici rimasti nei fluidi di lavaggio delle carcasse. Rimane adeso alle superfici di acciaio inox e di politilene ad alta densità non solo alla temperatura di 15,5 °C ma anche a  9,4 °C dimostrando così la necessità di  adottare modalità diverse per i vari siti da sanificare. Il grasso bovino  trasmette meglio l’E.coli O157:H7 alle superfici di contatto della lavorazione della carne rispetto al tessuto muscolare. I residui essiccati della lavorazione della carne facilitano l’adesione e lì inglobamento del germe. Se introdotto nei locali di lavorazione E coli O157:H7 deve essere considerato una fonte di contaminazione poiché il patogeno può aderire e crescere anche con poca  disponibilità di nutrienti, se la temperatura lo permette. 

Le superfici di materiale plastico di contatto favoriscono la formazione di biofilm meglio di quelle in acciaio inox. Quando adeso alle superfici secche  il patogeno aderisce più tenacemente rendendo più difficile la rimessione e con ciò dimostra  la necessità di appropriati trattamenti sanitizzanti  da adottare per la sanificazione delle superfici dopo la lavorazione.  I residui carnei facilitano l’adesione mentre i batteri alteranti possono permettere la crescita di E.coli O157:H7 nei loro biofilms. Quando i biofilms sono presenti, i sanitizzanti dovrebbero essere applicati alle massime concentrazioni ammissibili e lasciati a contatto delle superfici per lungo tempo. (Sofos  2009).

Listeria monocytogenes. L.monocytogenes è un germe ubiquitario nell’ambiente resistente a diverse condizioni  ambientali avverse. E’ presente nel modo vegetale (piante vive o morte), nell’acqua e nel suolo. E’ un contaminante di molti alimenti. In genere si ritiene che i biofilms presenti negli impianti di lavorazione degli alimenti siano   fonti importanti della contaminazione degli alimenti. 

Esistono 13 sierotipi distinguibili: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e,7. L.monocytogenes differentemente dai batteri Gram negativi descritti  è uno scarso formatore di biofilm. I ceppi isolati produttori di biofilms appartengono ai serovars 1/2a, 1/2b (divisione filogenetica II) mentre i ceppi del serovar 4b (Divisione filogenetica I) sono scarsi produttori. Esistono differenze  nella capacità di aderenza e di formazione tra i ceppi persistenti e quelli non persistenti di L.monocytogenes e tra i ceppi  delle 4 divisioni filogenetiche. Sono conosciute  differenze nella produzione di biofilms tra ceppi aderenti e non aderenti e tale divisione genetiche. Secondo alcuni ricercatori L.monocytogenes preferirebbe far parte di biofilms prodotti da altri batteri che elaborare un suo specifico. La struttura del biofilm  di L.monocytogenes è tridimensionale formando una struttura a nido d’ape o gruppi di aggregati circondati da spazi vuoti. Inoltre lo spessore del biofilm  può variare  a livello cellulare più ridotto al centro  e più denso in superficie. La crescita di L.monocytogenes è assai più lenta rispetto a quella delle listerie plantoniche. (Rodriguez-Lozano& coll.2009;Moretro &coll.2013). Sintetizzando: *Le cellule di L.monocytogenes hanno la capacità di  aderire a  varie superfici a contatto con alimenti quali polietilene, polipropilene e laminati. Se questi non sono adeguatamente puliti esse producono biofilms resistenti ai sanificanti. Molti tipi di biofilms contengono livelli elevati di L.monocytogenes che sopravvivono fino a 14 giorni su superfici di polietilene ad alta densità  e polipropilene tenute a temperatura ambiente. L..monocyto-genes sopravvive ed è stata isolata da superfici di laminati tenuti a temperatura ambiente (25°C:50% e 90% di umidità) in presenza di residui di cibo (prosciutto cotto) dopo 96 giorni. I biofilms sopravvivono meglio su superfici rugose che sulle superficie lisce di polietilene ad alta densità. I sanificanti sono più efficaci sui biofilms vecchi sviluppatesi su superfici lisce rispetto  a quelli cresciuti su superfici  ruvide, le nicchie umide sono le zone di principale sviluppo dei biofilms di L.monocytogenes. Sebbene i sanificanti siano efficaci sulle cellule adese platoniche, la loro efficacia diminuisce con l’aumentare del volume del biofilms. I sanificanti acido acetico, ac. Lattico, sodio ipoclorito, ammonio quaternario e  combinazioni con perossido d’idrogeno sono efficaci per la riduzione delle cellule  di L.monocytogenes, specialmente di quelle giovani. 

I biofilms prodotti da ceppi della Linea I hanno maggiori dimensioni di quelli prodotti da listerie delle linee II e III  quando sviluppatesi su  superfici di acciaio inox. Sulle stesse superfici formano biofilms entro 3 ore dalla adesione e  la maturazione  del biofilm si completa in 240 ore, ma porzioni dello stesso si verificano già dopo 96 ore. Un sanificante a base di acido lattico (pH 3,03) è molto efficace, mentre  i sanificanti  a base di ammonio quaternario  con pH elevato (10,5-11,5) riescono più efficaci di quelli a pH inferiore (6,2-8.7). L’attività dei sanificanti aumenta a temperature calde (25°C) e con un con  un tempo di esposizione di almeno 10 minuti. (Djordievic & coll. 2002; Sofos 2009; Mattos de Oliveira & coll.2010).

Campylobacter. Campylobacter è un genere di batteri appartenenti alla famiglia delle Campylobacteriaceae. Nel genere sono presenti 32 specie ve 13 subspecie. Nei vari ambienti naturali  possono formare aggregati non aderenti con forma di fiocco. di interfacci nei liquidi e biofilms. In proposito il la specie più studiata è il C.Jejuni che  è la specie predominante tra i Campylobacter presenti nelle carni di pollo. Campylobacter spp sono stati ritrovati in biofilms presenti in  apparecchi per  l’inaffiamento e in sistemi idraulici di allevamenti avicoli e di impianti di lavorazioni delle carni di pollo. Questi biofilms sono un rifugio per microrganismi patogeni e non patogeni perché li proteggono dagli stress ambientali e dagli agenti antimicrobici presenti nei sanificanti. Così i biofilms possono diventare fonti di contaminazione di C.jejuni nell’industrie avicole. I Campylobacter producono biofilms in scarsa quantità minore di quella formata dagli altri microrganismi. Si trovano  invece presenti in biofilms formati da Enterococcus faecalis ve Staphylococcus simulans normalmente presenti negli ambienti avicoli e nelle carni di pollo. La formazione di biofilms avviene in anaerobiosi sebbene in aerobiosi possa verificarsi ugualmente.(Jousua & coll.2006, Teh & coll.2010).

Enterococcus spp. Gli Enterococci sono germi Gram positivi cocchi che sono ubiquitari ma presenti nel tratto intestinale dell’essere umano ed animale. Il biofilm   prodotto è formato da proteine, acido teicoio e esopolissacaridi come nei biofilms di  Staphylococcus.

Riassunto.

Nella relazione sono descritti i germi produttori di biofilms nell’industria della carne e la loro localizzazione.

Summary Biofilms in meat industry

The report describes the bacteria which produce  biofilms  and their location in meat industry

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