Carlo Cantoni,libero docentein Ispezione degli Alimenti di origine animale.
Recenti isolamenti di bacilli spp in confezioni di latte UHT hanno suggerito di disporre una relazione su loro presenza e tassonomia come riportato di seguito.Il latte UHT,ottenuto sottoponendolo a un trattamento minimo di 135°C per1 sec.(ma normalmente trattato a temperature comprese tra 135°C e 150°C per 1-8 secondi in flusso continuo) seguito dall’im-mediato confezionamento in contenitori presterilizzati è virtualmente ve commercialmente sterile perchéil trattamento termico inattiva le forme batteriche vegetative e le loro spore.Dopo il riscaldamento il latteUHT è conservato a temperatura ambiente.Secondo le norme europee ,tale tipo di latte confezionato può contenere meno di 10 ufc/ml di cellule batteriche dopo incubazione a 30°Cper 15 gg.(Anonimo,1992).Le possibili alterazioni ,talvolta,si verificano in seguito a ricontaminazione durante il riempimento dei contenitori sono dovute all’attivita proteolitica e lipolitica degli sporigeni termofili presenti nel latte e nei prodotti lattiero caseari( p.e.latte in polvere)i bacilli termofili sono evidenziati con il conteg-gio su piastre di terreno nutritivo per aerobi (PLAo APC agar) incubate a 55°C.
Distinzione tra i ceppi batterici sporigeni.
Gli sporigeni isolati con tale modalità dal latte UHT sono divisibili in due categorie:a)termofili obbligati e b) termofili facoltativi,denominati anche temotolleranti (Burgess & coll. 2010)I termofili obbligati crescono solo a temperature elevate( tra 40°e70°°C) e comprendono le specie Anoxybacillus flavitermus e Geobacillus spp. (Flint& coll.2001;Scott & coll.2007).
Gli sporigeni termofili facoltativi appartengono al genere Bacillus e crescono alla temperature propriedei germi mesofili e a quelle dei termofili,secondo la specie.Alcuni esempi di questi sporigeni meso/ter-mofili sono B:licheneformis,B.coagulans,B:pumilus, B. sporothermophilus e B.subtilis.(Burgess &coll.(2010).
Le caratteristiche principali dei bacilli termofili sono:
-temperatura massima di crescita :45°-70.°°C
-temperatura minima di crescita 30-47°C
-intervallo di pH per la crescita 5,2-9,0
-degradazione della caseina da parte della maggioranza dei ceppi
-scissione dell’amido da parte della maggior parte dei ceppi.
Molti ceppi elaborano altri altri enzimi o dei prodotti metabolici che causano odori e difetti strutturali.
Fonti di inquinamentoLa provenienza dei ceppi sporigeni può essere identificata nelle stalle o negli impianti di trattamentotermico del latte.Precisamente nelle stalle il suolo è l’habitat principale degli sporigeni(!);il foraggio e le lettiere contaminate contaminano capezzoli e mammelle delle bovini e da queste i germi passano nel latte (II);il latte può subire una contaminazione crociata da foraggio insilato di scarsa qualità batte-riologica nel quale possono gli sporigeni possono essere presenti in quantita’ di 100-1000 ufc/ml (III);anche le macchine mungitrici sporche possono essere fonti di contaminazione così come le manualitànon igieniche praticate dagli addetti alla mungitura(IV-V).Negli impianti di trattamento de latte si possono trovare nei prepastorizzatori,nei preriscaldatori, e negli evaporatori e in altre parti degli impianti sottoforma di biofilms (Scott & Coll.20
.
Caratteristiche dei bacilli termofili
I membri del genere Bacillus ed i bacilli termofili obbligati hanno semplici necessità nutrizionali:non richiedono,infatti,specifici aminoacidi per la loro crescita e ,perciò,sono in grado di svilupparsiin terreni semplici come il triptone,soia,agar (TSA):La temperatura di crescita dei termofili obbligatiè di solito compresa tra 55°C e 65°C,variando tra le specie ed i singoli ceppi della stessa specie.
Per i Bacilli termofili facoltativi le temperature di crecita sono riportate nella tabella n 1.
Le specie principali di termofili obbligati sono:
-Anoxybacillus flavithermus
-Geobacillus sterothermophilus
-Geobacillus thermoleovorans
Nella tabella n 1 sono riportate le caratteristiche dei bacilli termofili facoltativi ed obbligati
Tabella n 1 Caratteristiche di alcuni bacilli termofili
Specie Anoxibacillus Geobacillus Geobacillus
flavithermus sterothermophilus thermoleovorans
t°massima di crescita 65-72 65-68 70
t°minima di crescita 30-38 37 35-47
crescita anaerobica si no no
intervallo di pH 6.0-9.0 6.0-8.0 5,2-8.0
sporangio ingrossato si si si
posizione spora terminale terminale terminale
reazione V-P positiva negativa negativa
crescita in NaCl % no no si
Riduzione nitrato/nitrito si variabile si
Idrolisi caseina si variabile variabile
Idrolisi gelatina no si variabile
Idrolisi amido si positiva variabile
Specie Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus
licheneformis subtilis coagulans pumilus sporothermodurans t°massima crescita 50-55 45-55 57-61 50-55 45-55
t°minima crescita 15 5-20 15-25 5-15 20
crescita anaerobica si no si no no
intervallo di pH 5.2-8 5.5-8.5 4.0-10.5 5.5-8.5 non conosciuto
sporangio ingrossato no no variabile no no
posizione spora centrale centrale sub terminale centrale terminale
reazione V-P + + variabile + -
crescita in NaCl 7% si si no si no
riduzione nitrato/nitrito si si variabile no no
idrolisi caseina si si no si debole
idrolisi gelatina si si variabile si no
idrolisi amido si si si no no
Da Burgess & coll.2010
Il genere Geobacillus
Il genere è composto da almeno 19 specie con cellule bastoncellari che appaiono singole o in brevi catene mobili per mezzo di flagelli peritrichi. Sono Gram positive ,ma la colorazione può variare fino alla Gram negatività.Le endospore entrola cellula sono di forma ellissoidale o cilidrica e sono posizionate terminalmente o subterminalmemtein sottili sporangi leggermente rigonfi o meno.Nel terreno solido di coltura le dimensioni delle cellule batteriche sono variabili.In certi terreni i ceppi prducono pigmenti.Sono batteri chemio organo trofici,aerobi o anaerobi facoltativi.L’ossigeno è un accettore di elettroni e può essere sostituto dal nitrato per alcune specie.Sono ceppi obbligatoriamente termofili.Le temperature di crescita sono comprese tra 37°e 75° C,l’optimun di crescita è compreso tra 55°-65°C.La crescita avviene ad intervalli di pH compresi tra 6.0 e 6.5.Per la loro crescita non richiedono la presenza di vitamine,NaCl eKCL.
Le prove di identificazione richiedono la valutazione della loro attivita nei confronti di:
-carboidrati.I Geobacilli produco acido ma non gas da glucosio,fruttosio,maltosio,mannosio e saccarosio. Molte specie non producono acido dal lattosio.La maggior parte delle specie produce catalasi,non deamina la fenilalanina,non degrada la tirosina e nonproduce indolo;è negativa alla reazione di Voges-Proskauer (V-P).La prova dell’ossidasi può risultare positiva o negativa.Le specie di Geobacillus fanno parte del genere Geobacilus,famiglia Bacilaceae,ordine Bacillales,classe Bacilli,phylum Firmicutes.
Caratteristiche metaboliche di Geobacillus stearothermophilus
Oltre alle caratteristiche riportate in precedenza i ceppi dela specie fermentano il glicerolo,il mannosioma non il lattosio e il galattosio.La sporulazione è una caratteristica fondamentale della specie.E’favorita dalla presenza nel terreno di cre-scita da solfato e da cloruro di manganese.Si produce in 10 giorni in substrato con pH 6-8,9.Il) G.stearothermophilus è impiegato per la produzione di diversi enzimi quali le alfa-amilasi resistentia 100°C per 1 h,la beta-mannasi termostabile,la proteasi alcalina extracellulare termostabile,l’alfa -L arabinofuranoside,la lipasi termostabile e la beta-xilosidasi.Il microrganismo è responsabile dell’alterazione detta “Flat sour” o inacidimento senza produzione di gasdelle conserve appertizzate.In quelle a base di latte le sue spore possono trovarsi oltre che nel latteùUHT nel latte concentrato scremato nei latti in polvere.
Caratteristiche di Geobacillus thermoleovorans
A quelle già citate si aggiungono:lo sviluppo delle colonie nei bterreni di coltura con colore bianco espesso con color crema,rugose in superficie.E’variabile al test dell’ONPG e del V-P,non produce indolo,idrogeno solforato. E’ lisindecarbossilasi,ornitindecarbossilasi,ureasi,tripofandeaminasi negativo.Produce acido dal cellobiosio,melobiosio,lattosio non tutti i ceppi),raffinosio,saccarosio e trealosio.Non scinde gli altri zuccheri (Dinsdale & coll,2011)
Caratteristiche di Anoxybacillus flavithermus
Caratteristiche aggiuntive alle precedenti sono le seguenti;catalasi e ossidasi positivo.Cresce su terreno con estratto di lievito,agar.Utilizza glucosio,mannosio,,maltosio,saccarosio,arabinosio,ramnosio e sorbitolo.Produce acetoina , arginindecarbossilasi,lisinadecarbossilas,triptofandeaminasi, e betagalossidasi.Non produce ureasi,ornitindecarbossilasi,indolo e idrogeno solforato. Non cresce a 68°C (Pitula &coll.2000,Burgess & coll.2010).Anoxybacillus flavithermus fa parte del genere Anoxybacillus (18 specie),famiglia Bacillaceae,ordineBacillales,classe Bacilli,phylum Firmicutes.
Bacillus sporothermodurans e altri bacilli sporigeni termoresistenti nel latte UHT.
Nel latte UHT possono trovarsi alune specie di bacilli con spore resistenti ad alte temperature come Bacillus cereus,B.sphaericus,B:licheneformis ,Brevibacillus brevis e due altre specie con forte capacità alterante;B.sporothermodurans e Paenibacillus lactis.Il B. spothermodurans è stato descritto da Pettersson & coll, (1996).Le principali caratteristiche del Bacillo sono riportate nella tabella n 1.Sue spore resistenti a 140°C per pochi secondi sono state isolate da diversi prodotti a base di latte (crema,latte con cioccolato,latte in polvere e latte ricostitutio) (Hammer&coll.2000) alterati in seguito alla germinazione delle spore e alla moltiplicazione delle forme vegetative.La specie B.sporothermodurans è geneticamente eterogenea avendo cloni diversi raggruppabili in tre grup-pi:I,II,III. Del primo gruppo fanno parte 16 ceppi,nel II e III sono collocati 3 ceppi ciascuno. Nella tabella n.1 sono riportate le caratteristiche distintive della specie.I ceppi per la crescita richiedono la presenza divitamina B 12 nel terreno di coltura.Le colonie sul terreno BHI agar si presentano piatte,circolari,intere,di colore beige o crema.Hanno spore sferiche o ellissoidali situate in posizioni para centrale o subteminalee qualche volta terminale con sporangi talvolta ingrossati.Producono acido da glucosio,D-fruttosio e malto sio e deboli quantità da saccarosio e trealosio.Possono acido(nonsempre)daamigdalina,arbutina,cellobiosio,gentobiosio,gliceroloemannitolo,D-mannosio,melezitosio,metl-D-glucoside,salicina,amido (debole)D-tagatosio,turanosio e Xilitolo(Heyndrix & coll.2012)La specie fa barte del genere Bacillus (191 specie),famiglia Bacillaceae.ordine Bacillacles,classe Bacilli,phylum Firmicutes.
Brevibacillus brevis
I Brevibacillus sono bastoncini Gram positivi,mobili con flagellimperitrichi.Hanno spore ellissoidali entro sporangi rigonfi. Le colonie sono piatte,lisci,circolari,intere.Aerobi stretti,catalasi positivi e ossidasi negativi.VP,idrogeno solforato ,indolo e leciti nasi negativi.Riduconoi nitrati a nitriti.Idrolizzano caseina,gelatina e DNA ma non amido ed urea.Crescono a pH 5.5-5.6.La loro crescita è inibita dal 2% diNaCl.La temperatura ottimale di crescita è di 30C,la minima è 20°C e la massima 50°C.Producono acidoma non gas dal D-fruttosio .La produzione di acidoè variabile da D-glucosio,maltosio e D-ribosio.Non scindono altri zuccheri (Shida & coll.1995)
Paenibacillus lactis
P.lactis è stato isolatoda latte non trattato e da latte UHT da Schedelman & coll.(2004).Sebbene le sporedel bacillo non fossero predominanti in questo tipo di latte,esse sono risultate derivare dal mangime.Le spore resistono alla temperatura di 120 °C.Le cellule del bacillo appaiono singole,diritte con le estremità arrotondate,ma muovendosi appaiono curve.Sono Gram negative e Gram variabili.Le endospore sonoelissoidali o cilindriche e sono posizionate subterminalmente o,occasionalmente,paracentralmente,usualmente ingrossano lo sporangio.Le colonie si sviluppano su TSA in quattro giorni e si presentano opache,di color crema,leggermente convesse,rotonde con margini frastagliati e trasparenti.Le microcolonie,mobili,si distribuiscono sulla superficie dell’agar in senso orario.Sono aerobiche.La temperatura massima di crescita è tra 50° e 55°C,mentre quella ottimale è compresa tra 30° e 40°C.Il pH ottimale per lo sviluppo è 7,quello minimo è tra 5.0 e 6.0,il pH più elevato di sviluppo è tra 10,5 e11.I bacilli non idrolizzano la caseina,ma scindono il beta-D-galattopiranoside.La riduzione del nitritoè è variabile.Negativesono le prove e di arginindiidrolasi,lisindecarbossilasi,ornitindecarbossilasi,utilizzazionedl citrato,produzione di idrogeno solforato,,ureasi,triptofano deaminasi,produzione di indolo idrolisi della gelatina.La reazione VP ènegativa o debolmente positiva.I bacilli idrolizzano l’esculina e producono acido da amigdalina,L-arabinosio,arbutina,D-cellobiosio,D-fruttosio,D-glucosio,glicogeno,lattosio,maltosio,mannitolo,D-mannosio,D-melibio-sio,D-raffinosio,ribosio,amido,saccarosio e D-trealosio.La produzione di acido è ceppo dipendente per D-arabinosio,L-fucosio,galattosio,gentobiosio,gluconato,D-melezitosio,metil-D-glucoside,metilxiloside , N-acetilglucosamina e salicina.Alcuni ceppi danno deboli reazioni on i seguenti substrati:amigdalina,L-arabinosio,arbutina,D-cellulosio,D-fruttosio,D-glucosio,mannitolo,D-mannosio,D-melizitosio,D-raffinosio,saccarosio,D-mannosio e D-xilosio.I ceppi di Paenibacillus lactis fano parte del genere Paenibacillus,famiglia Paenibacillaceae,ordine Bacil-lales,classe Bacilli,phylum Firmicutes.
Potenziale capacità alterante di bacilli termofili obbligati e di termofili facoltativi.
Ceppi di termofili obbligati e di termofili facoltativi producono acidi organici e vari enzimi termostabiliproteinasi e lipssi,alterando così latte e derivati .I termofili obbligati posseggono una bassa capacità alterante poiché il latte ed i suoi derivati sonocon-servati a temperature inferiori a 37°C e a questa temperatura non crescono.Maggiormente alterantisono,invece,i ceppi dei termofili facoltativi.Le alterazioni da essi prodotte sono riportate nella tabekaseguente.
Tabella 2, Tipi di alterazioni di latte UHT causate da termofili
Alterazione agente responsabile
Inacidimento Bacillus spp
Bacillus coagulans
Coagulazione dolce Bacillus spp
Geobacillus stearothemophilus
Paenibacillus lactis
Rigonfiamento del contenitore Bacillus spp.
Viscosità Bacillus subtils
Bacillus licheneformis
Odori e sapori sgradevoli B:cereus
I termofili obbligati non sono patogeni.Alcuni termofili come B-licheneformis,B.pumilus e B.subtilis possono elaborare tossine,ma solo a 30° e 37°C (De Jonge & coll.2009),B.cereus altera il latte chediventa imbevibile.I tre bacilli primi citati si ritiene siano stati implicati in episodi di intossicazione(Griffith 1955,Pavic 2005).
Termoresistenza delle spore dei termofili
Nella tabella n.3 sono riportatele termoresistente delle spore di termofili obbligati e facoltativi
Tabella n.3 Termoresistenza delle spore
°C sopravvivenza
Geobacillus sporothermophilus 121°C D= 42 sec.
“ “ 121°C D=7,3 sec.
“ “ 143°C 4 sec
Anoxybacillus flavithermus 143 °C 3 sec.
Bacillus licheneformis 120°C 3 sec-
“ “ 125°C 4 sec.
Bacillus subtilis 120° 4 sec.
Bacillus pumilus 135°C 10 sec.
Bacillus sporothermodurans 125°C 5 sec. D=2 min.;D=13
Da Burgess & coll.(2010)
Presenza di termofili nel latte e biofilms quali fonti di contaminazione
Il livello di termofili nel latte è,in genere,inferiore a 10 ufc/ml (Hill & coll.1994;Guiggon & coll.2002)solo in certe occasioni si sono riscontrate concentrazioni superiori a 100 uf/ ml..I termofili predominanti sono B:licheneformis e B.coagulans ma nel latte UHT sono presenti solo G:sporothermophilus e A.flavithermus.I termofili nell’impianto di pastorizzazione possono trovarsi nei biofilms.L’adesione dei batteri alle superfi-ci e il conseguente sviluppo in biobilm è una evenienza comune in ambienti naturali e negli impianti indu-striali.I biofilms sono definiti come microcolonie di cellule batteriche racchiuse in una matrice extracellu-lare di sostanze polimeriche (EPS)sviluppatesi rapidamente sulle superfici.La formazione di un biofilm si verifica in tre fasi: 1)Fase I (entro 1-10 sec.) su superfici ricoperte dacomponenti proteici del latte e con calcio fosfato. 2)Fase II entro 6-8 ore)avviene la colonizzazione primar-ria delle cellule batteriche nel substrato con formazione di esopolisaccaridi che supportano il processo. 3)Fase III: si verifica la stabilizzazione irreversibile dei biofilms.Sono biofilms maturi con le cellule battericheInclusi in canali entro la matrice organica.La formazione dei biofilma avvenga nelle parti dell’impiantodiLavorazione a temperature comprese tra 45° e 65 °C.Da queste formazioni si liberano i batteri che poi passano nel flusso del latte ed è quindi necessario trattarlo 150°c per accertarne la distruzione.
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Riassunto
Alcune volte il latte UHT risulta contaminato da bacilli termofili e termofili facoltativi
come si è verificato recentemente.Si è quindi ritenuto opportuno redigere una relazione
aggiornata sulla situazione come risulta dalle lettura del testo.
Summary
Thermophilic bacilli in UHT milk
The obligate and facultative thermophiles whichb to be presente in UHT hbave been
described in details.Their taxonomy, thermoresistent,spoilage capacity,endospores ,biofilm formation
and others characteristics have been also described
