Serratia marcescens: batterio alterante e patogeno facoltativo
Carlo Cantoni; Stefano Ibba
Libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale
Medico Veterinario-Milano
Introduzione
Dal 2010 ai giorni nostri si sono verificati diversi episodi di alterazione cromatiche (colorazioni rosse) a danno di ricotte segnalati In Veneto (Alberghina &coll , 2010 , in Veneto,nelle Marche e in Lombardia(Valtellina e Milanese).E’ presumibile che altri casi non siano stati segnalati e per evitare evidenti danni commerciali ed allarmismi conseguenti esagerati siè ritenuto opportuno elaborare questa descrizione/precisazione In tutti gli episodi segnalati Serratia macerans è stato ritenuto il microrganismo responsabili degli arrossamenti.
Le Serratiae spp.
Le Serratia spp sono germi bastoncellari, Gram negativi,riuniti nel genere Serratia, famiglia, ordine Enterobacteriales, classe Gamma Protobacteria, phylum Proteobacteria. Nel genere sono comprese 16 specie:S:entomophila, S.ficaria, S:fonticola, S.glossinae, S.liquefaciens, S.marcescens, S.marcescens subsp.marcescens, S.marcescens subsp.sakuensis, S.marinorubra, S:plymuthica, S.proteomaculans, subsp.proteomaculans, S.proteomaculans susp.quinovora, S.quinivorans, S.rubidae, S.symbiotica, S.mephitica.
La maggior parte ceppi di Serratia marcescens (compreso il ceppo KRED di Serratia marcescens subsp. sakuensis) di S:plymuthica e di. S.rubidiae elaborano un pigmento insolubile in acqua,unito alla membrana cellulare denominato prodigiosina. Questo pigmento conferisce alle colonie dei ceppi produttori una colorazione rossa intenso tendente al violetto e questa colorazione è conferita agli alimenti contaminati da S. marcescens e da S.rubidae. In base a prove di crescita su terreni poveri addizionati di varie fonti di carbonio,alla prova di riduzione del tetrationato, alla produzione del pigmento prodigiosina e di pirimina ,Grimont & Grimont (2006) nei ceppi di Serratia marcescens hanno individuato sette biogruppi (A1,A2,A3,A4,A5,TCT,TC) e 19 biovar (6 biovar per il biogruppo A2 e 8 biovar per il gruppo A5). I ceppi dei biogruppi A3 e A4 sono ubiquitari e non producono prodigiosina e i ceppi dei biogruppi A5 e TCT non sono pigmentati e sono presenti soprattutto negli ambienti ospedalieri,mentre,i ceppi pigmentati dei biogruppi A1 e A2 sono presenti soprattutto nell’ambiente. La specie Serratia rubidae ha tre sottotipi (B 1,B 2,B 3).
Nella tabella n 1 sono riportati i caratteri differenziali di Serratia spp. produttrici di prodigiosina.
Tab n 1 Caratteristiche differenziative di Serratia spp . produttrici di prodigiosina
prove
|
S. marcescens
|
S. plymuthica
|
S. rubidaea
|
S. marcescens susp.saquensis (+)
|
pigmento
|
+
|
+
|
+
|
+
|
odore di patata
|
-
|
V
|
-
|
+
|
crescita a 5 °C
|
+
|
+
|
10 C°
|
+
|
crescita a 40°C
|
+
|
-
|
V
|
-
|
indolo
|
-
|
-
|
-
|
-
|
riduzione tetrationato
|
D
|
-
|
-
|
-
|
gas dal glucosio
|
-
|
V
|
-
|
nd
|
B-xilosidasi
|
-
|
V
|
+
|
nd
|
Ossidazione glucosio e gluconato
|
+
|
V
|
+
|
nd
|
acido da :
| ||||
glucosio
|
+
|
+
|
+
|
+
|
adonitolo
|
V
|
+
|
+
|
+
|
L-arabinosio
|
-
|
+
|
+
|
+
|
Lattosio
|
D
|
(+/-)
|
+
|
ND
|
D-melibiosio
|
-
|
+
|
+
|
ND
|
D-raffinosio
|
D
|
+
|
+
|
ND
|
L-ramnosio
|
-
|
-
|
-
|
ND
|
D-sorbitolo
|
+
|
D
|
-
|
ND
|
Saccarosio
|
+
|
+
|
+
|
+
|
D-xilosio
|
-
|
+
|
+
|
-
|
Lisina decarbossilasi
|
+
|
-
|
D
|
ND
|
Ornitina decarbossilasi
|
+
|
-
|
-
|
ND
|
Arginino decarbossilasi
|
-
|
-
|
-
|
+
|
Tween 80 idrolisi
|
+
|
+
|
+
|
+
|
Utilizzazione fonti di Carbonio
| ||||
Adonitolo
|
+
|
-
|
+
| |
L-arabinosio
|
-
|
+
|
+
|
-
|
D-arabitolo
|
-
|
-
|
+
| |
L-arabitolo
|
+
|
-
|
-
|
+
|
Betaina
|
-
|
V
|
+
| |
Dulcitolo
|
-
|
+
|
-
| |
meso eretritolo
|
D
|
-
|
+
| |
malitolo
|
-
|
+
|
+
| |
melezitosio
|
-
|
+
|
D
| |
D-melibiosio
|
-
|
+
|
+
| |
Palatinosio
|
-
|
+
|
+
| |
Quinato
|
D
|
+
|
(+)
| |
L-ramnosio
|
+
|
-
|
-
|
-
|
D-sorbitolo
|
+
|
V
|
-
|
+
|
Saccarosio
|
+
|
+
|
+
|
+
|
D-tartrato
|
-
|
-
|
D
|
+
|
Tricarbillilato
|
-
|
-
|
D
| |
Trigonellina
|
D
|
-
|
+
|
-
|
Legenda (+) subsp.saquensis forma endospore, mobile, catalasi +,ossidasi -.idrolizza la caseina,la carne cotta e l’amido. Cresce in presenza del 7 % di NaCl. Utilizza per la crescita anche acido idrossibenzoico e ac.gentisico. Non produce acido da L-arabitolo. E’ metilrossonegastivo. Riduce i nitrati Resistenza al calore:Le colture in brodo sopravvivono al trattamento termico a 62°Cper 15 minuti in presenza dello 0,5% di NaCl e a 75°C per 20 minuti in btodo NG. (Ajthkumar &coll.2003;Grimont &coll 2006)
Simboli: +(90% ceppi positivi)-(90% ceppi negativi);v=reazione variabile;ND=non determinato
.
Nella n 2 sono riportate le prove necessarie per l’identificazione dei biotitpi di Serratia marcescens (Grimont &coll 2006)
Tab.n 2 Identificazione dei biotipi di S.marcescens
Caratteristiche a b a b a a b c d a b a a b c
Crescita su:
-Eritritolo + + + + + + + + + + + - - - - - - -
-Trigonellina - - - + - - + - + - - + + + + + - +
-Quinato e 4- idrossi- - - - - + - - - - + - + - + - + - -
benzoato
-3-idrossibenzoato - - - - - + + - - - - - - + - - - -
-Benzoato + + - - - - - - - - - - - - - - - -
-D-malato/m-tartrato + - + + v - - v - + + + v - - + - -
-Gentisato - - + + + + + v - + + - v + v + - -
-Riduzione del + + + + - + + + + - - + - - - + + +
tetrationato
-Pigmento rosso + + + + + - - - - - - - - - - - - -
Serratia rubidaea ha tre biotipi identificabili con le prove elencate nella tabella n.3
Tabella n.3 Identificazione dei biotipi di Serratia rubidaea
Prove biotipi
B 1 B2 B 3
Crescita su:
- Istamina + - +
-D-melezitosio - + + r
-D-tartrato + - v
-Tricabillilato
-Voges-Proskauer + - v
( O’ Meara)
-Malonato + + -
(Leifson)
(da Grimont & Coll.2006)
La produzione di prodigiosina
La prodigiosina è un pigmento color rosso non diffusibile in acqua,metabolita secondario dei biotipi di Serratia marcescens,di S.rubidaea, di S.plymuthica. Tutti batteri Gram negativi, Normalmente queste specie cromogene non sono patogene,mentre lo sono i biotipi non cromogeni che fungono da patogeni opportunisti. I biotipi isolati o provenienti dall’ambiente raramente lo sono. Il pigmento possiede attività antibiotica( Kalespertis coll.1975 Songia &coll. 1997). Serratia marcescens elabora anche un secondo pigmento solubile in acqua,di color rosso violetto con attività simile alla perossido dismutasi;la sua produzione è incrementata dalla aggiunta nel terreno di coltura di polimixina, gramicidina e valinomicina. Le colonie pigmentate di Serratia marcescens si vedono nettamente ad occhio nudo quando,nel terreno colturale,raggiungono un diametro di circa 1 mm (Haddix & coll.2000).
Le Serratia spp ,come le altre Enterobacteriaceae,crescono bene nei normali terreni di coltura in aerobiosi e in anaerobiosi.Si sviluppano ugualmente nei terreni sintetici in presenza di una sola fonte di carbonio.
La produzione maggiore del pigmento si verifica a 28 °C in brodo a base di semi di arachide,di sesamo e in brodo destrosio con caseina,S.marcescens è il maggior produttore di prodigiosina e la elaborazione dello stessa è in funzione della temperatura e viene inibita da temperature superiori a 37*C ( Gin &coll.2004).I terreni colturali impiegati per la biosintesi di prodigiosina contengono molteplici nutrienti; la tiamina e il ferro acido (Way & coll. 2005) stimolano la sua produzione.
Oltre a S.marcescens altri microrganismi formano prodigiosina e/o sui derivati: Pseudomonas magnesiorubra, Vibrio psychoerithrous, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra e, Rugamonas rubra
e da Actinomycetes Gram positivi come Streptoverticillium rubrireticuli e Streptomyces longisporus ruber (Aranafari &coll, 2005)
Il tripirrolo prodigiosina prodotto da S.marcescens fu caratterizzato per primo e venne dimostrata la sua localizzazione in vescicole extracellulari unite alla parete della cellula batterica e in granuli intracellulari (Kobayashi &coll 1991) e anche aderente alla parte interna della membrana (Irashani & coll.2004) in seguito a successive analisi si è evidenziata una serie di altri pigmenti correlati con differenti alchil sostituti (Wasseman ) riconosciuti come: undecilprodigiosina, meticloprodigiosina, streptorubina (butil-meta-cicloeptiprodigiosina) e la nonilprodigiosina (Fustner 2003). Pertanto Fustner ha sostenuto limitativa la denominazione tradizionale ed ha raccomandato di usare il termine “prodigiosina” solo in senso generico.
Habitat
Le specie del genere Serratia sono state isolare da vegetali (legumi, frutti, funghi e muschi), dall’intestino di roditori, da insetti,dalle acque e dal suolo. Percentuali d’isolamento di Serratia marcescens da vari ambienti sono state elencate da Grimont &coll. (2006) nella tabella qui riportata.
Tabella n.4 Distribuzioni percentuali di ceppi di S.marcescens isolata da vari ambienti
Biogruppi acqua vegetali pazienti ospedalizzati
(107 isolati) (37 isolati) (1.066 isolati)
A1 12 19 0,3
A2/6 23 5 7
A 3 21 38 7
A 4 34 38 26
A 5/8 7 0 47
TCT 3 0 13
Totale 100 100 100
In genere S:marcescens subsp. Marcescens costituisce solo il 10 % dei ceppi isolati dall’ambiente esterno,mentre è presente con frequenza negli ambienti ospedalieri
Patogenicità
Sebbene S.marcescens per lungo tempo sia stata considerata un germe non patogeno,negli ultimi trent’anni,alcuni ceppi sono diventati patogeni opportunisti causa di infezioni ospedaliere (Hejazi &
coll. (1997) I ceppi virulenti di S.marcescens si sono resi responsabili di infezioni ospedalieri provocando infezioni del tratto respiratorio, del tratto urinario, setticemie, meningiti, polmoniti,congiuntiviti cheratocongiuniviti, cheratititi, osteomieliti ed endocarditi (Hejazi &coll 1997;Kida &coll.2007; Kah &coll 2007;Matsuo & coll.2008;Castelli & coll 2008). I rapporti dei vari casi hanno segnalato la loro comparsa solo in pazienti con deficienza immunitaria o con malattie croniche debilitanti.
Serratia marcescens spp sono in grado di provocare malattie in animali,insetti,coralli e piante. La maggior parte dei ceppi isolati dai casi clinici non sono pigmentati. Negli ospedali si creano problemi per la resistenza dei ceppi isolati a diversi antibiotici come le cefalosporine,l’aztreonam, l’impenen, la cefaloxima e la ceftazidima (Kumer& coll.2002;Mammari % coll. 2004).
Adesione alle superfici
I ceppi di S:marcescens patogeni posseggono la capacità di aderire alle superfici dell’paziente ospite. I ceppi aderiscono sia a superfici biotiche che a quelle abiotiche come polistirene, legno, ferro, acciaio per la presenza di pili o fimbrie superficiali.
Ceppi di S,marcescens con fimbrie tipo 1 formano biofilms aggregandosi. La formazione di biofilm garantisce la protezione dei microrganismi aggregatisi in comunità dagli stress esterni. Inoltre, quando le cellule microbiche raggiungono elevate quantità entro il biofilm, questi diventa fonte di propagazione dei germi presenti causando problemi in campo clinico e negli ambienti di preparazione di alimenti.
Serratia spp e alimenti
S.marcescens si è sviluppata in vari alimenti come polenta, pasta, pane, ostie, mantenuti in ambienti umidi ed in frutti tropicali come il cocco ( Bollett & coll. 1986;Abd- Alla coll .2011). Riguardo i prodotti lattiero caseari la pigmentazione rosso sangue è dovuta alla proliferazione di ceppi di Serratia marcescens in grado di crescere a 5 °C psicotrofi o coldtolerans (tolleranti le temperature fredde).
Nella letteratura specifica, i primi ceppi psicrotrofi di S.marcescens sono stati descritti da Thomas &coll .1958) e da Witter & coll. (1961). In tempi più recenti altri ricercatori hanno isolato ceppi psicotrofi da latte crudo refrigerato dei quali il 3-6 % erano S.marcescens (Milliere & coll.1985; Ah-med & coll. 1989;abdu & coll.1997:Tariq & coll.2010)
Ray nel 1996 ha descritto ceppi di S.marcescens capaci di svilupparsi in alimenti refrigerati e di produrre lipasi e proteasi extracellulari termostabili( Abdou & coll.2003).
Questi ceppi definiti psicrotrofi dovrebbero essere studiati con grande attenzione dai ricercatori considerati i danni economici provocati: in particolare è necessario stabilire con precisioni gli intervalli di crescita esatti,dato trascurato incredibilmente da coloro che hanno affrontato lo studio dei ceppi alteranti.
Serratia marcescens:il Bacillo del miracolo
La storia dell’arrossante superficiale color sangue degli alimenti origina nel VI secolo,.quando Pitagora rilevò la presenza di una sostanza color sangue sul pane. Poi, nel 332 A:C, i soldati dell’armata macedone di Alessandro Magno videro anch’esse la formazione di macchie sanguigne sul loro pane e i soldati macedoni interpretarono la comparsa di macchie sanguigne come segno premonitore del sangue che si sarebbe sparso prima e dopo la conquista di Tiro da parte di Alessandro.
Nel 1800 un microscopista prus siano (C:G: Ehrenberg -1775-1876) riportò l’esistenza di circa 100 rapporti storici che descrivevano la comparsa miracolosa del sangue su alimenti. Lo storico e microbiologo E.R. Gaugan (1969) scoprì l’esistenza di 35 rapporti di san Guegran “fuoriuscente” dal pane eucaristico. Il primo caso registrato risale al 1169 in Danimarca.
Lo stesso fenomeno fu osservato in ostie dal Medio Evo al Rinascimento. Tutto ciò in quei tempi era considerato un miracolo.
La colorazione delle ostie ispirò Raffaello a dipingere il “Miracolo di Bolsena” su una parete nel Vaticano. Per onorare il miracolo di Bolsena,il papa Urbano II istituì la festa del Corpus Domini nel 1264. Nel dipinto il curato Peter di Praga è raffigurato mentre somministra la Comunione nella Chiesa di Santa Cristina.Quando il curato si accinse a somministrare le ostie si accorse ch’erano rosse e credette che fosse il sangue di Gesù transustato in esse.
Il primo ad osservare la presenza di batteri nella massa rossastra fu Antoine Van Leewenoek (1632-1723), ma la scoperta del microrganismo responsabile fu un farmacista di Legnaro (Padova) Bartolomeo Bizio che denominò il microrganismo Serratia marcescens dopo averlo osservato al microscopio esaminando lo striscio su vetrino di una macchia prelevata da una polenta arrossata. Al momento lo credette un fungo microscopico. Nei1817 Bizio, inumidì del pane e della polenta lasciandoli in un ambiente umido e caldo. Dopo 24 ore riscontrò l’arrossamento di pane e di polenta. Nel 1819 denominò Serratia il microrganismo per onorare il fisico italiano Serrati, inventore del piroscafo a vapore. Il nome specifico “marcescens” fu stabilito perché il germe causava un processo alterativo maleodorante della polenta e dei pani. Anche Ehrenberg si interessò delle macchie rosse del pane e nel 1848 inoculò parti delle macchie rosse sanguigne in patate, pane e formaggio svizzero riproducendo la colorazione della matrice originaria. Ehrenberg osservò i microrganismi presenti denominandoli batteri.
Fino alla fine del 1800 Serratia era denominata Bacillus prodigiosus, cambiato nel1920 con la denominazione data da Bizio (Gillen & coll.2011).
Identificazione di S.marcescens
Il risultato della colorazione di Gram (bastoncino negativo) e le sue relazioni con l’ossigeno (aerobio e anaerobio facoltativo), la prova dell’ossidasi (negativa) pongono il ceppo isolato tra le Enterobacteriaceae. La mobilità è il colore delle colonie confermano l’appartenenza del ceppo alle Enterobacteriaceae. Serratia marcescens riesce negativa al rosso metile. La specie idrolizza la caseina e degrada il triptofano e il citrato. S.marcescens produce acido lattico per via ossidativi e fermentativa.
Sanificazione.
Le Serratia marcescens sono suscettibili all’azione di vari disinfettanti come il cloro (1% di sodio ipoclorito) l’etanolo al 70%,alla glutataraldeide e ai composti a base di iodio. Particolarmente efficace riesce l’AHP ( perossido d’idrogeno accelerato –potenziato) in concentrazione dello 0,5 % che necessita di un contatto compeso tra 1 e 5 minuti primi.
Per sanificare degli ambienti di lavoro , prima di applicare il disinfettante scelto e necessario trattare le superfici con detergente alcalino e poi applicare il disinfettante.
Poiché il germe proviene dall’ambiente esterno si deve impedire la sua introduzione nell’ambiente di lavorazione da parte delle calzature del personale e da altri oggetti verosimilmente contaminati.
Serratia marcescens può resistere ai composti ammonio quaternari e alla cloexidina. Può contaminare anche i saponi.
Riassunto
S.marcescens in anni recenti ha provocato spesso alterazione di prodotti lattiero caseari umidi. Si è ritenuto utile redigere una rassegna su questo microrganismo e sulle sua sistematica e capacità alterante e patogena.
Summary
Serratia marcescens as alterative and opportunistic pathogen bacterium.
In these ultimate years (and actually) S.marcescens has been responsible of numerous chromatic (alterations (rednessses) of milk products (ricotta). A review on this alterative and opportunistic deseagreable bacterium has fournished here.
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