Carlo
Cantoni. Libero docente di Ispezione degli alimenti di origine animale. Milano
Stefano Ibba. Medico Veterinario, Milano
I
biofilms come si presentano in natura consistono principalmente di
microrganismi vitali e non vitali
inglobati in sostanze
polianioniche polimeriche
extracellulari adese ad una superficie solida (Chmelewski & coll. 2003). Le
sostanze polimeriche extracellulari sono
formate da polisaccaridi, proteine, fosolipidi, acidi tecoici, e nucleici e altre
sostanze polimeriche e con 80-85% di
umidità. Le EPS svolgono un’azione protettiva
ai microrganismi presenti nel biofilm fornendo nutrienti e impedendo l’accesso
di biocidi, metalli, tossine e impedendo l’essiccamento. I biolfilms
dell’industria alimentare possono contenere
residui e minerali derivanti dal
tipo di alimento lavorato e dall’acqua utilizzata. I biofilms possono
avere un elevato livello di organizzazione poiché possono essere presenti in comunità formate da singole o più
specie batteriche fornendo loro uno strato singolo o una struttura
tridimensionale oppure possono formare
aggregati a forma di fiocco o di
granulo
Formazione
del biofilm.
I batteri
presenti nelle superfici di lavorazione delle industrie della carne possono svilupparsi formando
biofilms. Questi ambienti presentano una varietà di condizioni tali da favorire
la loro formazione per la esistenza di nutrienti, umidità e presenza di microrganismi sulla superfici
delle carni. Cosi il biofilm, dopo la sua formazione, costituisce una fonte una
potenziale fonte di contaminazione degli
alimenti che può esitare nella loro
alterazione o nella trasmissione di germi patogeni. Inoltre, quando un biofilm
si distacca dalla superficie abiotica, i singoli microrganismi possono
diffondersi.
I batteri formanti biofilms sono stati Salmonella spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Campylobacte spp., Escherichia coli, E.coli STEC, Listeria spp., Staph.aureus.
Formazione
di biofilm.
La
colonizzazione batterica di una superficie solida è un processo polibasico che coinvolge
fattori fisico chimici e biologici. La formazione del biofilm avviene in 5
fasi: 1) una iniziale adesione del microrganismo platonico alla superfice
solida.
2) La
transazione da reversibile alla adesione irreversibile del microrganismo in
seguito alla sua produzione di polimeri extracellulari da parte del
microrganismo.
3) primo
preliminare sviluppo della struttura del biofilm.
4)
sviluppo di microcolonie nel biofilm
maturo.
5)
dispersione dei microrganismi dal biofilm nell’ambiente circostante.
In
dettaglio, il processo avviene così:
Il primo evento è costituito dall’assorbimento di molecole
organiche ed inorganiche sulla superficie solida. Ciò determina la formazione
di un substrato condizionanti la presenza del microrganismo, o primer
batterico, che favorisce la capacità del batterio ad aderire a questo substrato.
In particolare le proteine spesso formano substrati che favoriscono l’adesione batterica. Nella
produzione di alimenti si riscontra con maggiore frequenza la formazione di
biofilms in presenza di una elevata
concentrazione di proteine. Ad esempio le proteine del siero di latte sono
prevalenti negli impianti di lavorazione del latte ed è stato dimostrato che
aumentano l’adesione batterica aumentando anche l’adesione dei batteri lattici.
Dopo che si è formato il primo strato
condizionante la adesione batterica procede. I fattori e i procedimenti di
lavorazioni favorenti l’aumento dell’adesione batterica sono i valori estremi alti o bassi di pH e le elevate temperature di contatto
delle superfici di lavorazione, che entrambi
denaturano le proteine facilitando la formazione degli strati
condizionatori. Inoltre lenti flussi di liquidi sopra il biofilm aumenta il
tempo di contatto con i nutrienti presenti nello stesso. Altri fattori sono la
disponibilità di nutrienti, che è ubiquitaria negli impianti di produzione di alimenti, la durata del tempo
di contatto del batterio con la superficie, a fase di crescita del
germe e la idrofobicità del substrato. Interessante è sapere che la vitalità della
cellula batterica ha una importanza limitata sulla propensione all’adesività. Le
cellule batteriche vive o morte aderiscono alle superfici con la stessa propensione. L’adesione batterica è mediata
dalle fimbrie, pili, curli, fagelli, tutte appendici che si estendono
all’esterno della cellula. L’adesione batterica è anche rafforzata dai polisaccaridi extracellulari che formano
un ponte tra i batteri e lo strato condizionatorio. Il ponte è una combinazione
di legami idrogeno, ionici, covalenti, di
forze elettrostatiche, forze di Van der Walls e interazioni idrofobico, interazioni
dipolo-dipolo. Inizialmente, i legami tra i batteri e lo strato condizionatore
ma non sono tenaci e possono essere rimossi dal
lavaggio. Tuttavia, col tempo, questi legami sono rafforzati rendendo l’adesione
a contatto irreversibile.
Una
volta inglobati entro il biofilm e cellule lesionate o insufficientemente sviluppate per mancanza di nutrienti hanno la
opportunità di ripararsi, di metabolizzare i nutrienti presenti nello spazio condizionato, di
crescere e di riprodursi. Continuando a
moltiplicarsi i copiosi volumi di polisaccaridi extracellulari prodotti assicura una barriera protettiva intorno alle cellule. Le materia
inorganica ed organica che giunge a
contatto col biofilm vengono assorbite aumentando le dimensioni del biofilm e
rifornendo ulteriore nutrimento. I
biofilms si sviluppano rapidamente quando
vi è una fonte continua di nutrimento. In tali condizioni, un biofilm può considerarsi
“maturo” entro 24 ore e può continuare
ad aumentare in dimensioni millimetriche in pochi giorni. Lo sviluppo di un
biofilm può avvenire entro 1 ora
con il 10% di popolazione batterica aderente irreversibilmente allo strato
condizionatorio. Dopo 8 ore di
produzione più del 91% di batteri sono adesi irreversibilmente.
Come
il biofilm matura, aumenta la resistenza contro vari disinfettanti
probabilmente per la produzione di polisaccaridi extracellulari. La rimozione
del biofilm durante le operazioni di sanificazione routinarie diventa un
compito difficile da realizzare perché l’aumento del tempo di contatto col
sanitizzante e quello dell’attività
meccanica necessaria richiedono maggior costo del personale e un tempo più
lungo per la rimozione.
Presenza
di biofilms nelle strutture di lavorazione
e produzione degli alimenti.
Biofilms
sono rinvenibili non solo sulle superfici di lavorazione ma anche sulle
superfici di prodotti, specialmente vegetali. Le superfici delle strutture sono costituite da acciaio inossidabile, alluminio,
vetro, guarnizioni di Teflon e possono supportare biofilms. Le superfici degli
ambienti di lavorazione possono essere
contaminate per via aerea, dal personale e dalle operazioni di pulizia. Biofilms
sono stati riscontrati su superfici a contatto con alimenti come guarnizioni,
nastri trasportatori, pastorizzatori e in attrezzature con fessure e spazi
morti. Queste zone spesso sono difficili da raggiungere durante la pulizia e la
sanificazione creandosi così delle condizioni
ideali per lo sviluppo di biofilms. Anche le superfici corrose, rotte, fessurate
trattengono particelle di cibo e costituiscono siti ideali per permettere la formazione di biofilm.
(Sofos 2009).
Biofilm
nell’industria della carne.
Durante
le fasi di abbattimento dell’animale, le carcasse possono essere contaminate da
batteri provenienti da diverse fonti quali le feci, la pelle, il tratto
gastrointestinale, i linfonodi, l’aria, l’essere umano. Lo scuoiamento e
l’eviscerazione potenzialmente causano
la dispersione di microrganismi conseguentemente le superfici di
lavorazione della carne e le attrezzature presenti nell’ambiente possono venire contaminate dalla carcassa, dagli ingredienti, dall’acqua
da roditori e da insetti. Sulla superficie della carne si sviluppano batteri
durante la refrigerazione con variazioni della popolazione batterica tra quella della carne e quella delle attrezzature.
I batteri presenti
possono essere non patogeni e patogeni.
I principali generi isolati da carni bovine sono: Pseudomonas, Staphylococcus,
Enterobacter, Flavobacterium, Klu-viera, Moraxella, MicroGram negativicoccus, Bacilus,
Kocuria, Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Brochotrix, Gemella, Proteus, Corynebacterium
, Erysipelotrix, Kurthia, Enterococcus. In generale i batteri Gram negativi formano più biofilms rispetto ai
Gram positivi compresa L.monocytogenes. La formazione più elevata di
biofilms è stata osservata per Acinetobacter, Citrobacter e Pseudomonas.
Gli Enterobacter formano poco biofilm paragonato a quelli degli altri
enterobatteri.
Batteri
non patogeni.
Pseudomonas è il genere più presente e le Pseudomonadaceae
sono pure i principali alteranti le
carni. La contaminazione di queste durante la lavorazione proviene
dall’acqua, le mani, e i materiali. Vi sono prove che le Pseudomonas spp
presenti sulle superfici dei tavoli di lavorazione possono colonizzare le superfici inferiori delle canaline e dei tubi
di acqua delle stanze di lavorazione. I
microrganismi sono trasportati per via aerea da aerosols prodotti durante la
pulizia dei tombini e degli ugelli dei depuratori. Il biofilm delle Pseudomonas
spp è composto da t polisaccaridi (levano, alginato Pel, cellulosio), DNA, proteine,
materiale proteico non definito, Rhamnolipidi, pili di tipo IV (TAP) e flagelli.
Batteri
patogeni.
Salmonella. Diverse ricerche hanno dimostrato la capacità di ceppi di Salmonella di formare biofilms su
varie superfici abiotiche come plastica,
(politilene polistirene), gomma, cemento, acciaio inossidabile che possono
trovarsi comunemente nelle fattorie, macelli, abitazioni, industrie di
lavorazione delle carni, cucine, toilette e bagni. Salmonelle possono formare
biofilms anche su vegetali (alfa alfa, lattughe). Inoltre le salmonelle
sono capaci di aderire e di formare comunità
batteriche, microcolonie e anche biofilms maturi sulle cellule vegetali e
animali. I biofilms sono composti da
esolipolisaccaridi, polisaccaridi (cellulosa, acidi colanici, antigene
capsulare o anionico) e da materiale proteico
costituito da fimbrie tipo 1 (Pef), fimbrie curli (Csg), fimbrie polari
(Lpf fimbrie aggregative (Tafi o agf), da fattori di colonizzazione (Bcf ee Sth) e da flagelli.
Escherichia
coli produttori di tossina Shiga. La specie Escherichia coli comprende ceppi membri della normale popolazione commensale degli esseri umani ed
animali e ceppi patogeni per gli stessi
soggetti citati.
I ceppi patogeni fanno
parte di due gruppi: gli E.coli
intestinali (InPEC) e gli E.coli extraintestinali (ExPEC). Questo secondo gruppo è responsabile di infezioni
del tratto urinario (UPEC), di sepsi neonatali e di anziani, di meningiti, e di
varie malattie infettive animali incluse
le mastiti. Gli inPEC sono classicamente divisi in 8 sottogruppi
in base alle malattie provocate,i loro fattori di virulenza e la loro
filogenesi.
Gli 8 patotipi sono: gli E.coli aderenti-invasivi (AIEC) associati
con la malattia di Crohn, gli E.coli diffusamente aderenti (DAEC), gli E.coli
enteroaggregativi (EAEC), gli E,coli enterossigeni (ETEC), gli E.coli
enteropatogeni (EPEC), gli E.coli produttori di tossina Shiga
(STEC) che comprendono i ceppi enteroemorragici E.coli (EHEC) e gli E.coli enteroinvasivi (EIEC) che
comprendono anche la Shigella.
I ceppi STEC sono diffusi in tutto il mondo nelle
acque e sono patogeni alimentari.
I bovini sono un importante serbatoio di STEC e in questa specie
colonizzano asintomaticamente; possono essere presenti in nelle feci di pecore,
capre, tacchini e suini. Gli episodi delle malattie da STEC sono tipicamente associate
a carni bovine contaminate: tuttavia il latte non pastorizzato, l’acqua contaminata, le verdure fresche e certi frutti
contaminati e succhi di sidro si sono rese responsabili di malattia. Gli STEC possono persistere per parecchio tempo
nell’ambiente esterno, nelle acque e nel terreno. I ceppi EHEC sopravvivono per
più di 8 mesi nell’acqua contaminata da feci bovine. Gli STEC sono anche una
delle principali preoccupazioni negli impianti durante la lavorazione delle
carni e la contaminazione delle carcasse con STEC può verificarsi nelle fasi di macellazione, scuoiamento
e taglio. Pertanto popolazioni di STEC sono rinvenibili sulle superfici della
varie attrezzature impiegate e possono diventare fonti di ulteriori contaminazione dei tagli carnei. La presenza
di STEC nei bovini e negli impianti di
lavorazione è ben documentata ed è stato ipotizzato che la loro capacità di
formare biofilms su differenti superfici
sia responsabile della distribuzione e
della persistenza di STEC negli stabilimenti di produzione della carne.
Diversità
genetica dei ceppi STEC.
Il
sierotipo STEC predominante più noto associato con episodi di malattia
è lo O157:H7. Questo è uno dei primi
sierotipi identificato quale causa della sindrome uremica (HUS). Tuttavia altri
sierotipi clinicamente importanti sono stati identificati: O26, O45, O103, O111 e
O145. Altri sierotipi (O113:H21 e O91:H21) in genere causano sporadici casi di HUS. Un altro sierotipo responsabile di numero avvenuti casi in Germania nel 2011 è il sierotipo O104:H4.
Il microrganismo è un tipico EAEC
con presenza del gene, trasportato
per via orizzontale da un
batteriofago, stex2 responsabile
della produzione della tossina (STEAEC).
Nella formazione dei biofilms
intervengono vari fattori;
1) Nella
prima fase di contatto con le superfici (Primo contatto) : la mobilità dei flagelli; la superficie di
adesione, (rogosità, idrofobicità), il tipo di substrato,la temperatura,il
pH,le forze ioniche;
2).
Nella fase di attacco: le adesine fimbriali: tipo 1; curli, pili tipo 4. Fibre
lunghe polari, fimbrie F9, capsula, LPS, proteine;
3)Nella
fase di maturazione: gli autotrasportatori (adesine),EPS, PGA, cellulosa acido
colanico, capsula, LPS, QS e proteine.
4) La
fase finale è la dispersione del biofilm ma le cause per ora sono sconosciute.La
matrice del biofilm di E.coli
,quindi,formata da 3 differenti EPS: la poli-N-acetilglucosamina, (PGA),
l’acido colanico e/o cellulosa e
LPS..Negli ambienti di lavorazione delle carni gli STEC aderiscono alle superfici di acciaio inox,di polistirene,di
vetro, di poliuretano, di polietilene ad alta densità. (Vogeler &
coll.(20014).
Caratteristiche
del biofilm.
E.coli O157:H7 rimane per 4 giorni sulle superfici di acciaio inox insieme agli acidi organici rimasti nei
fluidi di lavaggio delle carcasse. Rimane adeso alle superfici di acciaio inox
e di politilene ad alta densità non solo alla temperatura di 15,5 °C ma anche a 9,4 °C dimostrando così la necessità di adottare modalità diverse per i vari siti da
sanificare. Il grasso bovino trasmette meglio
l’E.coli O157:H7 alle superfici di
contatto della lavorazione della carne rispetto al tessuto muscolare. I
residui essiccati della lavorazione della carne facilitano l’adesione e lì
inglobamento del germe. Se introdotto nei locali di lavorazione E coli O157:H7
deve essere considerato una fonte di contaminazione poiché il patogeno può
aderire e crescere anche con poca
disponibilità di nutrienti, se la temperatura lo permette.
Le superfici
di materiale plastico di contatto favoriscono la formazione di biofilm meglio
di quelle in acciaio inox. Quando adeso alle superfici secche il patogeno aderisce più tenacemente rendendo
più difficile la rimessione e con ciò dimostra
la necessità di appropriati trattamenti sanitizzanti da adottare per la sanificazione delle
superfici dopo la lavorazione. I
residui carnei facilitano l’adesione mentre i batteri alteranti possono
permettere la crescita di E.coli O157:H7 nei loro biofilms. Quando i biofilms
sono presenti, i sanitizzanti dovrebbero essere applicati alle massime
concentrazioni ammissibili e lasciati a contatto delle superfici per lungo
tempo. (Sofos 2009).
Listeria monocytogenes. L.monocytogenes
è un germe ubiquitario nell’ambiente resistente a diverse condizioni ambientali avverse. E’ presente nel modo
vegetale (piante vive o morte), nell’acqua e nel suolo. E’ un contaminante di
molti alimenti. In genere si ritiene che i biofilms presenti negli impianti di
lavorazione degli alimenti siano fonti
importanti della contaminazione degli alimenti.
Esistono 13 sierotipi
distinguibili: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e,7. L.monocytogenes differentemente dai batteri Gram negativi
descritti è uno scarso formatore di
biofilm. I ceppi isolati produttori di biofilms appartengono ai serovars 1/2a, 1/2b
(divisione filogenetica II) mentre i ceppi del serovar 4b (Divisione filogenetica I) sono scarsi produttori.
Esistono differenze nella capacità di
aderenza e di formazione tra i ceppi persistenti e quelli non persistenti di
L.monocytogenes e tra i ceppi delle 4 divisioni filogenetiche. Sono
conosciute differenze nella produzione
di biofilms tra ceppi aderenti e non aderenti e tale divisione genetiche. Secondo
alcuni ricercatori L.monocytogenes preferirebbe far parte di biofilms prodotti
da altri batteri che elaborare un suo specifico. La struttura del biofilm di L.monocytogenes è tridimensionale formando
una struttura a nido d’ape o gruppi di aggregati circondati da spazi vuoti. Inoltre
lo spessore del biofilm può variare a livello cellulare più ridotto al
centro e più denso in superficie. La
crescita di L.monocytogenes è assai più lenta rispetto a quella delle listerie
plantoniche. (Rodriguez-Lozano& coll.2009;Moretro &coll.2013). Sintetizzando:
*Le cellule di L.monocytogenes hanno la capacità di aderire a varie superfici a contatto con alimenti quali polietilene, polipropilene e laminati.
Se questi non sono adeguatamente puliti esse producono biofilms resistenti ai
sanificanti. Molti tipi di biofilms contengono livelli elevati di L.monocytogenes che sopravvivono fino a 14 giorni su
superfici di polietilene ad alta densità
e polipropilene tenute a temperatura ambiente. L..monocyto-genes sopravvive
ed è stata isolata da superfici di laminati tenuti a temperatura ambiente (25°C:50%
e 90% di umidità) in presenza di residui di cibo (prosciutto cotto) dopo 96
giorni. I biofilms sopravvivono meglio su superfici rugose che sulle superficie
lisce di polietilene ad alta densità. I sanificanti sono più efficaci sui
biofilms vecchi sviluppatesi su
superfici lisce rispetto a quelli
cresciuti su superfici ruvide, le
nicchie umide sono le zone di principale sviluppo dei biofilms di
L.monocytogenes. Sebbene i sanificanti siano efficaci sulle cellule adese
platoniche, la loro efficacia diminuisce con l’aumentare del volume del
biofilms. I sanificanti acido acetico, ac. Lattico, sodio ipoclorito, ammonio
quaternario e combinazioni con perossido
d’idrogeno sono efficaci per la riduzione delle cellule di L.monocytogenes, specialmente di quelle
giovani.
I biofilms prodotti da ceppi della Linea I hanno maggiori dimensioni
di quelli prodotti da listerie delle linee II e III quando sviluppatesi su superfici di acciaio inox. Sulle stesse
superfici formano biofilms entro 3 ore dalla adesione e la maturazione del biofilm si completa in 240 ore, ma
porzioni dello stesso si verificano già dopo 96 ore. Un sanificante a base di
acido lattico (pH 3,03) è molto efficace, mentre i sanificanti
a base di ammonio quaternario con
pH elevato (10,5-11,5) riescono più
efficaci di quelli a pH inferiore (6,2-8.7). L’attività dei sanificanti aumenta
a temperature calde (25°C) e con un
con un tempo di esposizione di almeno 10
minuti. (Djordievic & coll. 2002; Sofos 2009; Mattos de Oliveira &
coll.2010).
Campylobacter.
Campylobacter è un genere di batteri appartenenti alla famiglia delle
Campylobacteriaceae. Nel genere sono presenti 32 specie ve 13 subspecie. Nei
vari ambienti naturali possono formare
aggregati non aderenti con forma di fiocco. di interfacci nei liquidi e biofilms. In
proposito il la specie più studiata è il C.Jejuni che è la specie predominante tra i Campylobacter
presenti nelle carni di pollo. Campylobacter spp sono stati ritrovati in
biofilms presenti in apparecchi per l’inaffiamento e in sistemi idraulici di
allevamenti avicoli e di impianti di lavorazioni delle carni di pollo. Questi
biofilms sono un rifugio per microrganismi patogeni e non patogeni perché li
proteggono dagli stress ambientali e dagli agenti antimicrobici presenti nei
sanificanti. Così i biofilms possono diventare fonti di contaminazione di
C.jejuni nell’industrie avicole. I Campylobacter producono biofilms in scarsa
quantità minore di quella formata dagli altri microrganismi. Si trovano invece presenti in biofilms formati da
Enterococcus faecalis ve Staphylococcus simulans normalmente presenti negli
ambienti avicoli e nelle carni di pollo. La formazione di biofilms avviene in
anaerobiosi sebbene in aerobiosi possa verificarsi ugualmente.(Jousua &
coll.2006, Teh & coll.2010).
Enterococcus
spp. Gli Enterococci sono germi Gram positivi cocchi che sono ubiquitari ma
presenti nel tratto intestinale dell’essere umano ed animale. Il biofilm prodotto è formato da proteine, acido
teicoio e esopolissacaridi come nei biofilms di
Staphylococcus.
Riassunto.
Nella relazione sono descritti i germi produttori di
biofilms nell’industria della carne e la loro localizzazione.
Summary Biofilms in meat industry
The report describes the bacteria
which produce biofilms and their location in meat industry
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