ENTEROCOCCUS SSPP.: breve rassegna

 Carlo Cantoni, Libero docente in ispezione degli alimenti di origine animale, Milano

                                                                                                                                            

Gli Enterococchi sono batteri Gram positivi con forma sferica od ovoidale che si presentano appaiati o in corte catene (Thiercelin 1899). Sono anaerobi facoltativi, a-sporigeni e chemorganotrofi, fermentativi obbligati. Essi, tipicamente, hanno una temperatura ottimale di crescita di 35 C°, e possono crescere tra 10° e 45°C. (Sherman  1937). Si sviluppano in brodo nutritivo col 6,5% di NaCl, idrolizzano l’esculina in presenza del 40 % di bile (Facklam 1973). Sono catalasi negativi e non posseggono citocromi completi, sebbene alcune specie producano una catalasi di bassa intensità d’azione (pseudocatalasi). Sono generalmente omofermentanti, producendo acido lattico dalla fermentazione del glucosio senza produzione di gas (Murray 1990,Klein 2000). Alcune specie sono mobili,come E. gallinarum, ed  E.casseliflavus (Graudal 1957, Mundt 1986).  Una pigmentazione gialla di intensità variabile è presente in E.sulfureus e  in E.casseliflavus ed E.mundtii. Questi  specie pigmentate sono normalmente isolate da vegetali.

                                                                                                                     

Le analisi filogenetiche  dei cocchi catalasi negativi, basate sulla comparazione di circa 1400 basi del gene 16S rNA  hanno dimostrato la vicinanza più stretta degli Enterococchi con le specie dei generi Vagococcus,Tetragenococcus e Carnobacterium invece che a Streptococcus e Lactococcus spp (Facklam&Coll.2002). 

                                

Le specie del genere  Enterococcus finora identificate in base alla ibridazione DNA-DNA,al sequenziamento dl gene 16S  RNA e alla composizione chimica della parete cellulare hanno permesso di individuare le seguenti 43 specie: E.alcedinis, E. acquimarinus, E.avium, E caccae, E.camelliae, E.canintestinus, E.canis, E.casseliflavus, E.cecorum, E.columbaE. E.devriesei, E.diestrammenae, E.dispar, E.durans, E.eurokensis, E.faecalis, E faecium, E.flavescens, E phoenicula, E.gallinarum, E.gilvus, E.haemoperoxidans, E. hermanniensis, E. hirae, E.italicus, E.lactis, E.lemanie, E,maleodoratus, E. moraviensis, E. mundtii, E. olivae, E.pallens, E.phoenifunicula, E.plantarum, E.porcinus, E. pseudoavium, E.quebecensis, E.raffinosus, E.ratti, E.rivorum, E. rotai, E. saccarolyticus, E.saccharolyticus subsp.saccharolyticum, E.saccharoyticum subsp.taiwanensis, E.saccarominums, E.seriolicida,E.silesiacus, E.solitarius, E. sulfu-reus, E.termitis,E. thailandicus, E ureasiticus, E.ureiyticus, E.wiikkiensaniis,E.villorum, E.xiangfaringensis.    

                                                                                                                               

Specie di enteroccus e loro habitats : essere umano, animali, vegetali, acque. 

Gli enterococchi sono batteri ubiquitari  negli intestini degli umani e degli animali, sono quindi comuni negli ambienti contaminati da loro materiale fecale, sono pure presenti nei prodotti alimentari di origine animale e nei vegetali. Sono isolati facilmente dai loro  diversi substrati e coltivati  facilmente. Sono utilizzati come indicatori di inquinamento fecale delle acque  (Clausen 1977,Anonimo 1998),e come probiotici per umani e animali. In genere gli enterococchi non sono considerati come patogeni primari,ma per la loro capacità di acquisire antibiotico resistenza essi si sono rilevati patogeni  negl un acquisire antibiotico resistenza essi  si sono rivelati patogeni negli ospedali (Linden & Coll.1989). Il vasto e massiccio impiego di antibiotici promotori di crescita nei mangimi ha provocato un aumento di antibiotico resistenza negli enterococchi di origine animale e questa resistenza sembra si sia diffusa agli enterococchi umani. Vi è anche evidenza che alcuni ceppi di E.faecalis posseggano parecchi fattori determinanti di virulenza / Franz & Coll.2001;Fisher &  Coll,2009) e che pure ceppi di E.faecium, causa di infezioni nell’essere umano appartengono a un determinato gruppo genomico di E. faecium (Vancanneit & Coll.(2002).   

                                                                                                                    

Enterococchi nell’essere umano: colonizzazione intestinale ed infezione 

Molto di ciò che si conosce sulla colonizzazione intestinale deriva da studi eseguiti nel tratto gastrointestinale dell’essere umano e sulle sue feci. Gli enterococchi sono localizzati principalmente  nel piccolo e grosso intestino  nei quali gli Enterococchi sono rilevanti nel digiuno, ileo, cieco e rettiosigmoide. Ovviamente sono pure presenti nel materiale fecale umano. Comunque rappresentano l’1% del microbiota intestinale. Si trovano  pure nella cavità orale, di rado,nello stomaco umano. E.faecalis ed E.faecium sono comuni nelle feci umane  e,occasionalmente nello stomaco si trovano E.durans , E.avium, E caccae. In genere E.Faecalis ed E.faecium sono le specie isolate più frequentemente, seguite da E.durans, E. allinarum e da E.hirae (Layton & Coll.2010). E.casseliflavus ed E.saccharolyticum non risultano presenti. Alcuni membri del genere Enterococcus possono riuscire patogeni opportunisti e, oltrepassando la mucosa intestinale, provocano infezioni in pazienti immunocompromessi o defedati (Berg 1996, Donskey 2004). Gli Enterococchi più frequentemente isolati dai siti infettati sono E.fecalis,E.faecium (75%) degli isolati,E.durans, E.avium,E.gallinarum,E casseliflavus,E.hirae, E.mundtii, E.dispar,E raffinosus nell’ordine percentuale decrescente.  E.gilvus ed E.pallens solo occasionalmente (Devriese & Coll.1994,Tannock & Coll.2002).   
                                                

Virulenza degli Enterococus spp.

Le specie di Enterococcus dotate di maggiore virulenza sono E faecalis ed E.faecium. Sono ceppi isolati principalmente da infezioni  umane, da alimenti e, talvolta da ceppi starter (Borgman & Coll.2004, Ben Omar & Coll.2004). Diversi fattori determina-no la virulenza degli Enterococchi: 1) la capacità di colonizzare il tratto intestinale che è il loro habitat normale. 2) la capacita di aderire a diverse proteine di superficie con la trombospondina, la lactoferrina e la vibronectina. 3) la capacità di aderire all’epitelio della cavità orale e alle cellule renali embrionali. Si ritiene che le infezioni siano endogene per trans locazione e infezione dei batteri attraverso l’epitelio intestinale con passaggio e ingresso nei linfonodi e quindi con la loro diffusione tramite i vasi linfatici ad altre zone del corpo (Franz & Coll.1999). Inoltre la sostanza aggregante  (Agg) presente sulla superficie di E.faecalis  da luogo alla formazione di aggregati cellulari contribuendo alla patogenesi.L’agg è una glicoproteina di superficie e non è presente in E.faecium (Hallgreen & (Coll. 2008). Un'altra proteina della superficie cellulare è l’Ace  (adesione del collagene) che può avere un ruolo nella patogenesi delle endocarditi (Koch & Coll.2004),Anche una terza proteina di superfici extracellulare è presente in  E.faecalis (Shoulkar & Coll.1999).Si ritiene che promuova l’ adesione,la colonizzazione e l’evasione dal sistema immunitario e che possa avere nella antibiotico resistenza .Exp può contribuire alla formazione di biofilms  che favoriscono la resistenza agli stress ambientali e l’adesione alle  cellule eucariote del tratto urinario (Borgman & Coll.2004). Ceppi di E.faecalis exp negativi hanno plasmidi che trasferiscono il gene diventando anch’essi produttori di biofilms. I ceppi patogeni di E faecium isolati da casi clinici hanno il gene exp responsabile della loro virulenza. Il gene esp è risultato assente negli E.faecium isolati da latte (Manum& Coll.2003. La capacità di produrre biofilms è fondamentale per la patogeniesidi endocarditi ed infezioni de tratto urinario .Altri fattori responsabili della virulenza sono i pili,che favoriscono l’adesione alle cellule eucaristiche, le citolisine (o beta-emolisine), la ialaruronidasi, la gelatinasi e la serina proteasi (Fisher & Coll.2009). I ceppi patogeni sono resistenti alla vancomicina e alla teicoplanina in genere e diversi antibiotici. 
                                   

Enterococcus spp negli animali: colonizzazione intestinale. 

Gli intestini degli animali  rappresentano  la maggiore riserva degli enterococchi. Come  avviene per l’essere umano, essi  possono infettare gli animali (Aarestrup & Coll.2003). Enterococchisono stati isolati da campioni fecali di vari animali: gatti,topi,cavie, conigli,cani,polli,mosche,scimmie, mammiferi rettili, uccelli.

Le specie di enterococchi isolate più comunemente dall’intestino di mammiferi sono: E.faecalis, E.hirae, E.durans (Devriese & Coll.1987,1991). E cecorum è stato isolato da feci di pollame. Il confronto tra i ceppi di Enterococchi isolati da animali con quelli umani hanno dato risultati contrastanti. Con la tecnica PGFE ceppi di E faecium vancomicina resistenti isolati da vegetali confrontati  con E faeicium isolati dall’essere umano i ceppi sono risultati simili tra loro (van de Boogard & Coll. 2000, Hammmerm & Coll.2004 ), viceversa, mediante analisi con i metodi AFLP e MLST  effettuate su ceppi de E,faecium VRS isolati da  animali e ceppi isolati da pazienti ospedalizzati, i ceppi sono risultati geneticamente differenti tra loro (Willems & Coll.2000). Inoltre la MLST ha dimostrato che i ceppi degli ospedalizzati erano raggruppabili in un sottogruppo specifico denominato CC17, mentre gli E.faecium isolati da animali domestici appartenevano ad altri gruppi Willems & Coll.2005.20012). Tuttavia questa distinzione non è stata supportata da altri ricercatori (Damberg & Coll.2008, Hamme-  rum &Coll.2012, De Regt & Coll.2012). Anche per E faecalis si è riscontrata la stessa situazione. Ceppi di E.faecalis umani  sono risultati altamente simili a quelli isolati da suini, in base alla antibiotico resistenza, geni di virulenza e tipologia secondo le MLST/PGF (Larsen & Coll, 2011, Lebreton & Coll.2014) 

                                                                          

Enterocchi nell’ambiente: vegetali, acqua, suolo. 

Gli enterococchi sono ampiamente usati come indicatori di contaminazione fecale dall’animale all’uomo e viceversa. Le fonti originarie degli Enterococchi sono discusse in quanto diversi ricercatori le ritengono di origine fecale, quindi batteri transienti, mentre altri ricercatori individuano nei vegetali la fonte primaria (Sherman 1937,Ostrolenk & Coll.1944,Mundt 1961,1963). Dai vegetali sono state isolate  nuove specie come E,rotai, E,plantarum ed E.ureilyticus (Svec 2011).

Gli Enterococchi sono stati isolati da acque dolci e salate. 

I ceppi di di E:faecalis  sono predominanti.ma sono state isolate differenti specie come E.pseudoavium., E.casseliflavus, E.faecium, E.mundtii, E.gallinarum,  E,dispar, E.hirae, E.duranjs, E.flavescens, E.hamoperoxidans ed E.moraviensis (Kuhn &Coll.2003). Nelle acque le specie considerate indici di contaminazioni fecale sono E.faecalis ed E.faecium. Recentemente altre specie sono state isolate dalle acque quali: E.rotai, E.ureilyticus da acque potabili, E:aquimarinus dall’acqua del mare ed E.lrivorum da ruscelli  incontaminati  (Svec 2005;Niemi & Coll.2012). Ugualmente E.moraviensis, E.siliacus, E.ureaticus ed E.quebescens sono stati isolati da acque di superficie (Svec & Coll,2001,2006,Sistek &Coll.2012). Le loro fonti originarie sono sconosciute. Gli Enterococchi sono presenti ed isolabili insedimenti, suoli sabbie. 

Enterococchi negli alimenti.

Per la loro naturale esistenza come contaminanti di carne crude, di prodotti lattierocaseari, per a loro termotolleranza la debole scarsa tossicità e per la loro capacità di acidificazione, gli  Enterococchii sono  stati riconosciuti come ingredienti naturali e fondamentali nei prodotti fermentati di origine animale e vegetali. Ceppi di Enterococchi  sono stati usati per la preparazione di formaggi tradizionali a base di latte di capra, pecora e bovina nei Paesi Mediterranei. I livelli di Enterococchi nei vari tipi di formaggi  sono compresi tra 10⁴ e 10⁶ UFC/g. E. faecalis ed  E.faecium sono i più comuni. Gli Enterococchi contribuiscono alla maturazione e allo sviluppo dell’ aroma in questi prodotti per le loro proprietà proteolitiche ed esterasiche, per la produzione di diacetile e di altri importanti composti aromatici (Falquie-Moreno & Coll.2006) Oltre ai formaggi gli Enterococchi svolgono un ruolo importante nella preparazione di prodotti vegetali fermentati. Oltre alle desiderate proprietà fermentative gli Enterococchi si sono, però, responsabili di alterazioni di prodotti carnei cotti  (carne in scatola, luncheon meat inscatolato, prosciutto cotto) (Magnus Coll.1986,1988). Infine gli Enterococchi sono presenti, di solito, in numero elevato nei vegetali,specialmente nella fermentazione delle olive,nelle quali sono ritenuti dei contaminanti (Fernandez Diaz 1983,Floriano & Coll. 1988; de Castro & Coll.2002). Sebbene gli Enterococchi siano usati come indicatori di contaminazione fecale nell’ambiente, la loro importanza come  indicatori di igiene nelle preparazioni industriali  di alimenti è discussa  (Birollo & Coll.2001). La loro presenza negli alimenti è controversa per la loro associazione con le infezioni umane (Vanconeit &Coll.2002,De Vuyst & 2003). E.faecium ed E.faecalis sono le specie più frequente-mente presenti nei prodotti alimentari. Altre specie riscontrate con minore frequenza sono: E,sanguinicola, E. devriese, E.maleodoratus, E.casseliflavus, E. gallinarum, E.gilvus, E.hermanniensis, E.durans. Le specie E.camelliae, E.italicus, E.thailandicus ed E.lactis sono state isolate da foglie di tè, formaggi italiani, salsicce fermentate e da formaggi prodotti con latte crudo. 
                                    

Presenza di Enterococchi e salubrità dei cibi. 

Aspetti igienici della salubrità degli alimenti con presenza di Enterococchi. Riprendendo quanto esposto prima circa la patogenicità di ceppi di Enteroccus spp. e tenendo presente le proprietà tecnologiche presentate da Enterococcus spp. è notorio che alcuni ceppi di questo genere posseggono caratteristiche dannose  come l’antibiotico resistenza e i fattori di virulenza prima descritti. La virulenza degli Enterococchi potrebbe localizzarsi in  determinati ceppi di specie particolari ed è noto, come descritto in precedenza, che i ceppi patogeni possono provocare processi infiammatori mediante  formazione di ammassi cellulari ,evasione dalla attività immunitaria,adesione a superfici abiotiche e biotiche, formazioni di biofilms e sviluppo di antibiotico resistenza. Questa è dovuta a determinanti genetici localizzati in plasmidi coniugativi o nei transposoni (Hasman & Coll.2005; Zanella & Coll. 2006) La multiantibiotico resistenza  stata più  di sovente segnalata per E.faecalis per la sua conosciuta capacità di acquisire e trasferire i geni di resistenza. E’ben conosciuto che gli Enterobatteri esprimono  un elevato livello di resistenza ai glicopeptidi in seguito all’uso eccessivo di vancomicina  nei pazienti ospedalizzati così come per l’impiego di aviparcina, utilizzata come promotore di crescita nei mangimi per animali (Khun & Coll.2008). Inoltre, secondo  Falquie-Moreno & Coll.(2006), alcuni ceppi di Enterococcus spp. possono esibire antibiotico resistenza verso streptomicina,(E.faecalis), isoxolipenicillina, cefalosporine, monobactami, aminoglicosidi, lincosamide, cloramfenicolo e polimixine. Le resistenze ad ampicilline, tetracicline, macrolidi, aminoglicosidi, cloramfenicolo, trimetroprim, ulfametozaxolo, chinoloni e streptogamine sono esempi di resistenza acquisita da E.faecium e da specie correlate (Falquie-Moreno & Coll.2006). Tra i fattori di virulenza già descritti per gli Enterococchi la citolisina (beta-emolisina) di E.faecalis può essere facilmente trasferita per mezzo dei plasmidi coniugativi (Ike & Coll.1987) e per questa ragione i ceppi beta-emolitici sono considerati indesiderabili negli alimenti ed il loro uso come starter è inadatto. La sostanza di aggregazione (AS) è una proteina di superficie di E.faecalis è responsabile dell’aggregazione batterica che facilita il trasferimento con plasmidi. La Exp, o proteina di superficie, è un altro fattore di virulenza responsabile dell’adesione alle cellule eucariote e della elusione alla risposta del sistema immunitario dell’ospite (Gomes& Coll.2010). La gelatinasi (Gel) è una metalloendopeptidasi coinvolta nella idrolisi di gelatina, collagene, emoglobina e di altri peptidi biologicamente attivi. Si ritiene causi infiammazione. Altri fattori di virulenza sono la ialuronidasi e la capacità di formare biofilms che provoca l’aderenza del batterio al  tessuto dell’ospite. E’importante sottolineare che l’incidenza dei determinanti della virulenza è più elevata negli isolati clinici di Enterococchi,seguiti dai ceppi isolati da animali e dagli alimenti. (Ben Omar & Coll.2004,Khan & Coll.2008), comunque è difficile distinguere i ceppi innocui dai ceppi patogeni poiché i geni di virulenza vengono facilmente scambiati tra i ceppi (Robredo & Coll.2000, Eaton & Coll., Messi & Coll.2006).  Tuttavia, recentemente, Buhnik-Rosenblau & Coll.(2013) studiando  le relazioni genetiche fra 105 ceppi di E.faecalis isolati da diverse fonti e possessori di differenti gradi di virulenza hanno individuato l’esistenza di 3 gruppi (clusters). Mentre i ceppi patogeni e i commensali sono dispersi del gruppo 2 e 3, i ceppi usati come probiotici o isolati da formaggi rientrano nel gruppo 1 che comprende ceppi non virulenti. La virulenza o meno dei ceppi di E.faecalis è stata determinata sulla presenza di geni responsabili della stessa. Questi risultati dimostrano la natura diversa di E,faecalis,che comprende  ceppi patogeni, commensali e probiotici e aprono la via per la distinzione  fra i vari ceppi.                                                                                             

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