YERSINIA ENTEROCOLITICA IN ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE, VEGETALE E PATOGENICITA’

Carlo Cantoni, libero docente in Ispezione e controllo degli alimenti di origine animale, Milano                                                                                                                                                              

Le Yersinia spp. sono batteri gram negativi, anaerobi facoltativi  asporigeni, facenti parte del genere Yersinia (famiglia Enterobacteriaceae, ordine Bacteriales, classe Gamma Proteobacteria, divisione Proteobacteria, regno Bacteria). Nel genere sono  presenti 19 specie: Y.aldovae, Y.aleksciae,Y. bercovieri,Y. enterocoltica, Y. enterocolitica subsp. enterocolitica, Y.entercolitica subsp.poliartica, Y.enteromophaga, Y..frediksenii, Y.intermedia, Y.kristensenii, Y.massimiliensis, Y.mollarettii, Y.nurmi, Y-pekkanenii,Y. Pestis, Y.philomiragia, Y.pseudotubercolosis, Y.pseudotubercolosis subsp.pestia, Y. pseudotubercolosis subsp.pseudotuberolosis, Y.rohdei, Y.ruckeri, Y.similis, Y.wautersii.

Y.enterocolitica può provocare  malattie nell’ essere umano denominate yersiniosi. Le loro manifestazioni nell’essere umano possono così riassumersi:                                                        

- forma enterica. Simile alla patologia provocata da salmonella, generalmente ad andamento benigno può evolvere come tosscosi importante nei bambini al di sotto di 5 anni. 

- sindrome della  fascia iliaca destra. Si tratta si tratta di una adenite mesenterica spesso accompagnata da una infiammazione degli ultimi centimetri dell’ileo, con conseguente ileite terminale acuta. Questa malattia è propria degli adolescenti e dei giovani adulti. 

- rare forme setticemiche con ascessi epatici

- eritemi nodosi, soprattutto nelle femmine oltre i quarant’anni

- artriti, casi descritti nei paesi  scandinavi. 

Negli ultimi anni è stata segnalato il ruolo di certi alimenti come causa di infezione. Le ipotesi attuali sul loro ruolo sembrano ritenere favorevoli la refrigerazione, il consumo di legumi crudi e la conduzione igienicamente errata delle mense. In effetti Y.enterocolitica può svilupparsi in substrati con pH tra 4 e 10, tollerano una concentrazione di sali del 5% e possono crescere tra 0 e 42° C. Nel settore degli alimenti di origine animale i suini rappresentano un serbatoio particolare in quanto possono albergare nelle loro  tonsille ceppi di Y.enterolitica. 

  

Caratterstiche di Y,enterocolitica.  

I ceppi di Y.enterocolitica   formano  6  biotipi (1A.1B.2.3.4.5) a loro volta divisibili in 76 sierotipi in base agli antigeni somatici (O)termoresistenti o più raramente agli antigeni flagellari (H) e fimbriali  (K). Questi ceppi sono eterogenei riguardo il proprio potenziale patogeno.

I ceppi di Y enterocolitica sono distinti in :

- ceppi strettamente adattati all’uomo,

- ceppi ambientali o non adattati:

- O:3 e O:9. Raramenti isolati dall’ambiente e presenti nel suino portatore (contenuto intestinale, lingue faringe, tonsille).

-O:8 isolato di solito da acque, da alimenti vegetali lavati con acqua contaminata, da vegetali  coltivati e concimati, da prodotti lattierocaseari. Numerosi sierotipi non patogeni non coinvolti in malattie animali e umane sono presenti in acqua, suolo, vegetali, animali.                                                                    

I ceppi biotipo 4 (sierotipo O:3) e  biotipo 2 (sierotipo O:9) sono  quelli frequentemente isolati da casi umani ad esempio, in Germania l’86 % dei casi di yersinosi sono stati attribuiti al Bio/Sierotipo 4/O:3 (RKI 2012). Ceppi del biotipo 1 A sono stati spesso isolati da campioni ambientali, da feci umane e ambientali e da alimenti.

Nella tabella seguente n.1 sono riportati i  sierotipi isolabili da fonti animali.

Tabella n 1.  Fonti animali e Yersiniae isolate e isolabili

animali da fattoria                                 Y enterocolitica

suino	O:3,O.5,27,O:8,O.9
bovino, pecora, capra	O:5,27,O:9

animali domestici  

cane , gatto

O:3,O:5,27

                                                                                                                               

-  selvatici  

lepre coniglio	O:2,3,O:8
Roditori	O.3,O.8,O:9

 

-animali da zoo

scimmie

O:3:O:8

-Virulenza. Tutti i ceppi  patogeni di Y.enterocolitica posseggono un largo simile plasmide di virulenza (pYV) di70 kbp (paia di kilobasi) sul quale sono localizzati i geni fattori di virulenza (compreso Yops, o Yersinia outer proteins) (Cornelis & coll.1987). Essi svolgono il ruolo principale nella patogenicità del batterio e altri geni sono situati sul cromosoma del microrganismo come precisato  di seguito.

I fattori di patogenicità consistono:

a) nel tropismo dei ceppi per il tessuto linfoide;

b)qui giunti (incubazione di 6-7 giorni dall’ingestione) i ceppi sopravvivono e si moltiplicano nel tessuto linfatico provocando l’apoptosi dei fagociti;

c) i fattori di virulenza espressi dai geni permettono di modulare la

1) risposta immunitaria,

2) di interferire con la fagocitosi, impedendola,

3) di ridurre l’azione ossidativa dei leucociti,

4) di distruggere i leucociti  provocando la loro apotosi,4) di alterare l’azione delle citochine.                                                                      

Come prima accennato, i fattori di virulenza plasmidica sono costituiti dal plasmide di virulenza pYV codificante per numerose proteine presenti sulla parete esterna dei ceppi patogeni e dalla Yersinia adherence protein codificata dal gene yadA che codifica la adesina principale proteina di membrana che media l’adesione dei ceppi patogeni alle cellule della mucosa intestinale.                                                              

I fattori di virulenza crosomiali sono tre: 

a) l’invasina , codificata dal gene inv ,una proteina di membrana, o fattore principale di adesione, il quale provoca il legame con le cellule M dell’ospite.

b) la proteine Ail codificata dal gene all. Attachement invasion Locus, fattore invasivo che consente la colonizzazione e la penetrazione dei linfociti nel fegato e nella milza.

c) la enterotossina termostabile che facilita l’invasione del  patogeno nei tessuti danneggiando l’epitelio intestinale. Altri geni cromosomiali sono presenti nei ceppi di Yersinia : a) il gene YstA che condiziona la secrezione fluida intestinale. b) il gene YPM stimolante le cellule T.c) l’HPI regolante influenzante l’assorbimento del ferro. (Fredriksson –Ahomaa & coll,2010).

Alcuni fattori intrinseci ed estrinseci condizionanti la sopravvivenza e la crescita di Yersiniae negli alimenti.

I più importanti fattori intrinseci sono  la fonte alimentare, il pH e l’aW   Nutrizionalmente la yersinia non è un microrganismo esigente. Questo batterio è in grado di moltiplicarsi in substrati con pH compreso tra 4 e 10, con un optimum pH di circa 7,6. E’sensibile a bassi pH. L’acido citrico è meno inibitorio dell’acido acetico che inibisce la sua crescita a pH 5,58  (Concentrazione superiore allo 0,16 % vol./ vol.). Concentrazioni di sale  del 7% e più inibiscono lo sviluppo, agendo da batteriostatiche. Y.enterocolitica inibisce la Y.enterocolitica alle concentrazioni di 80 mg Kg nei salumi. Quanto alla Aw secondo alcuni il limite di crescita è di O,96.     

Fattori estrinseci 

I fattori estrinseci più importanti sono la temperatura e  l’atmosfera dell’imballaggio. La Yersinia patogena contrariamente alle altre enterobacteriacea patogene è psicrotrofa. Il tempo di raddoppiamento alla sua temperatura ottimale è di 34 minuti circa a 28- 30°C (Schiemann 1989). Ovviamente cresce più lentamente alle temperature di refrigerazione. E’stato dimostrato che il numero di Yersinie in carne suina può raggiungere 10⁹ ufc/cm² in 5 giorni (Nissen & Coll.2001). Molti fattori di virulenza si esprimono a 26°C ma non a 37°C (Fredriksson-Ahmoaa & Coll.2010). 

Come prima precisato, la temperatura ottimale di crescita è compresa tra  42-44 °C.  Le Yersiniae sono relativamente sensibili al calore, ma con i trattamenti termici applicati correttamente ai cibi  sono prontamente distrutti tutti i sierotipi. Sono distrutte dalla pastorizzazione a 72°C per 15-20 secondi. Poiché è un batterio anaerobio facoltativo può crescere in condizioni anaerobie. Cresce bene nelle atmosfere modificate (Harrison & Coll.2002) ma elevate concentrazioni di CO₂ aumentano la lag fase e la crescita è, quindi, più lenta. Cresce bene in carni confezionate sottovuoto o in atmosfera modificata a 5°C.I valori di D, o resistenza termica, a 50°C (D₅₀,D₅₅, e D₆₀ sono di1 min,1 mn e 0,55 rispettivamente ( carne tritata). 

         

Yersinia in  taluni alimenti di origine animale.  

Gli alimenti sono spesso ritenuti come fonte di Yersinia enterolitica patogena sebbene i ceppi patogeni negli alimenti siano rari. Con studi epidemiologici, le infezioni da Y.enterocolitica sono state causate dal consumo di carne suina cruda o cotta inufficientemente. Negli Stati Uniti le infezioni sono state associate con il consumo di preparazioni carnee a base di frattaglie suine (budelli ecc.) preparati in cucine casalinghe negli stati del Sud (Lee & Coll.1990;Jones & Coll.2003). I prodotti a base di carne suina sono dovute alla frequente  presenza di Y.enterocolitica nel suino. Il solo sierotipo patogeno isolato nel Nordeuropa e in Germania è il 4/O:3. Biosierotipi 2/0:5,27 e  2/0:9 sono stati isolati sporadicamente nel Regno Unito e il 3/0:3 e 3/O:3,27 in Giappone (Frederikssan –Ahomaa & Coll.2010). Casi di Yersiniosi sono stati segnalati nella maggior parti del modo, ma i casi registrati nella UE sono drasticamente differenti. L’incidenza segnalata nella Comunità è di 1,7 casi per 100.000 soggetti. Tale valore medio oscilla tra lo 0,02-14,4 % tra  gli stati membri. (ECDC). In Nord America i casi di yersiniosi risultano lo O,3 per 100,000, in Canada 1,5 per 100.000 e il ceppo maggiormente responsabile delle infezioni nei due continenti è il 4/O:3 (Laukkanen –Ninios & Coll: 2014). 

   

Trasmissione all’essere umano

La maggior parte dei casi di yersiniosi sono sporadici. La fonte principale è stata la carne di suino cruda o poco cotta come hanno evidenziato  studi comparando i genotipi isolati dai suini con quelli isolati da umani (Laukkanen-Ninios % Coll.2014). Particolarmente i bambini possono essere affetti assumendo il germe da animali domestici o da ambienti contaminati tramite  i ciucci o tettarelle. Altri tipi di alimenti hanno causato infezioni da Yersinia come latticini, insalate miste con vegetali, prosciutto, insaccati freschi crudi.                                                                                                  

Alcune percentuali di presenza di Yersinia enterocolitica in carni                                                                                                          

Nella tabella seguente n. 4 sono riportate le percentuali di presenza di Yersinia enterocolitica in carni Laukkanen-Ninios & Coll.2014).

Tab.n.4 Presenze percentuali di Yersinia nelle carni identificate con PCR.                                       

Lingue suine: (279 campioni,3 lotti) 98.100,45, frattaglie suine (842 camp. 4 lotti) 51,62,9,2. Carcassa di pollo (Broiler) 9.Carcasse suine (2172 campioni,4 lotti) 27,16,22,2. Carne trita suina (807 campionì,5 lotti)38,25,35,5). Suini  707,5 lotti) 18,11,32,2.10). Selvaggina (101 campioni,2 lotti) 38,6. Carne di pollo (797,3 lotti) 1,0,3,1. Pesci (250,2 lotti) 0,4.                                                                                                                         

Altri alimenti: Lattuga (305 campioni,3 lotti) 3,3.0. latte (61 campioni) 0. Latte fermentato (500 campioni,2 lotti) 1,2). 

Dati da Laukkanen-Ninios & Coll.(2014)

Isolamento ed identificazione di Yersinia enterocolitica.

Tab.5 Biotipi       

	1 A	1B	2	3	4	5
Lipasi (idrolisi tween)	+	+	-	-	-	-
Idrolisi esculina	V	-	-	-	-	-
Produzione di indolo	+	+	(+)	-	-	-
Fermentazione D-xilosio	+	+	+	+	+	+
reazione de Voges proskauer	+	+	+	+	+	+
fermentazione trealosio	+	+	+	+	+	+
riduzione del nitrato	+	+	+	+	+	+
pirazinamidasi	+	-	-	-	-	-
B-D-glucosidasi	+	-	-	-	-	-
prolina peptidasi	V	-	-	-	-	-

legenda (+) positivo, (-) negativo, (V) variabile 

       

Nella tabella n 6 sono elencati i geni responsabili della virulenza di Y.enterocolitica

Tab.n.6 Geni responsabili di virulenza di Y. Enterocolitica 

Inv – invasina (una proteina  esterna di membrana necessaria per la translocazione del batterio attraverso l’epitelio intestinale)

ail- adesina (proteina esterna della membrana che può contribuire all’adesione, inva-ione e  resistenza alla lisi medita dal complemento)                       

virF- attivatore transcrizionale

myfA- fattore mucoide di Yersinia (antigene fimbriale e adesina presunta) (C)

stA-  yest B-yest C-enterotossine (tossine di Yersinia stabile al calore che possono contribuire alla patogenesi di diarrea) (C)

fepA-proteina recettrice enterochelina

fedD –proteina  recettrice enterochelina

Fes-enterochelina esterasi

tccC- tossina insetticida similev a proteasi   (C)

ymoA- modulatore yersinia

hrP-subtilin/kexin proteasi simile    (P)

Sat-streptogramma acetiltranferasi

yadA- Yersinia adesina A

ysa-   apparato secretorio di Yersinia 

legenda C =Gene cromosomiale,P=gene plasmidico (da Sabina & Coll.2011)

                                                                                         

Terreni colturali d’Isolamento 

 Nella tabella 7 sono riportate modalità e terreni d’isolamento di Y enterocolitica :

Tab.7 Modalità e terreni d’isolamento di Y.enterocolitica   

terreno di arricchimento    (condizioni)	terreno d’isolamento  (condizioni)
TSB(22-25°C, 1 g)	CIN (32°C,18h)MAC (22-25°C,48 h)
PSB (4°C ,14-21 gg)	CIN 32*C,18h);MAC (22-25°C,48h)
lievemente selettivo
(PSB 10°C,10 gg)	CIN E MAC (30°C,1g)
PBS (25°C ,1-3 gg)	CIN (30°C,24h)
selettivo
ITC (25°C,2 gg)	SSDC (30° C,24 h)
MRB (22-25°C,2-3 gg)	CIN (32°C, 18 h)

Legenda:

PBS= tampone  salino fosfato tamponato;    

PSB=brodo salino fosfato temponato, con sorbitolo e Sali biliari;

ITC= brodo irgasan-ticarcillina potassio clorato;

SSDC=Salmonella-Shigella desossicolato calcio clorato in piastra;

MRB=Rappaport brodo modificato;

TSB=brodo tripticase soya;

CIN=cefsulodin-irgasan-novobiocina agar           

                                                        

BIBLIOGRAFIA

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