STREPTOCOCCUS BOVIS (SBSEC group) negli umani, animali e in alimenti: specie e patogenicità

Carlo Cantoni, libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale, Milano 

                                                                                 

Lo  Streptococcus bovis  fa parte del guppo D della Lancefield  secondo  la classificacazione sierologica basata sugli antigeni polisaccaridici presenti sulla parete cellulare (Lancefield 1933). Gli Streptococcus bovis sono normalmente presenti nel tratto intestinale degli esseri umani e degli animali come bovini, pecore, suini, cavalli e cani, oltre a trovarsi anche in latte e formaggi. Nell’essere umano sono ritenuti come agenti occasionali di batteriemie, di sepsi neonatali, di meningiti neonatali e degli adulti. Sono associati con le endocarditi infettive (IE), col carcinoma colorettale  e con malattie epatiche (Lin & Coll,2011).                                                                                                 

A partire dal 1970 fu possibile individuare  le diversità dei ceppi di Strep. bovis con l’uso di determinazioni biochimiche caratterizzando i ceppi in biotipi. I ceppi del biotipo I ( ceppi di Strep.bovis classici) fermentavano il mannitolo e producevano glucano extracellulare dal saccarosio, mentre i varianti del biotipo II non possedevano tali capacità. I ceppi del Biotipo II sulla base di altre proprietà biochimiche. Negli ultimi due decenni le caratterizzazioni genetiche e le tecniche di sequenziamento del 16S rDNA, l’ibridazzazione quantitativa  del DNA e l’analisi filogenetica hanno permesso  la distinzione delle singole specie come indicato nella tabella n. 1.                                       

Gli streptococchi del gruppo D sono: S.bovis, S.equinus, S. caprinus, S.gallolyticus, S.  alactolyticus, S.infantarius, S.macedonicus.   
       

Tabella n. 1 Caratterizzazione del gruppo D di streptococchi mediante l’ibridazzione del DNA-DNA con sonde 16S rDNA secondo Schlegel & Coll,(2003).      
                                                         

DNA I cluster (gruppo)                                                                                                                 

1)Streptococcus bovis biotipo II.1 - feci bovine e endocardite umana

2)Streptococcus equinus - feci equine e tratto riproduttivo

DNA  cluster II (gruppo)

Streptococcus gallolyticus sub specie gallolyticus (precedentemente classificato come S.bovis biotipo I.)                                                                                                                                
1) S.galllolyiticus - endocardite umana, mastite bovina, feci di koala e opossum 

2) S.caprinus - feci di capra       

S.gallolyticus  sub specie macedonicus                                                                                   

1) S.macedonicus - mastite bovina prodotti lattierocaseari  

S.gallolyticus subspecie pasteurianus                                                                                               

1)S.bovis biotipo II.2 - endocarditi umane, sangue, infezioni,  prodotti lattiero caseari

DNA cluster III (gruppo)                                                                                                                 

1)S.infantarius sub specie infantarius - endocarditi, umane,sangue,infezioni, prodotti lattiero caseari                                                                                                            
2)S.infantarius sub specie coli - endocarditi umane, urine, feci sangue, infezioni                                                                                                                                          

DNA cluster IV ( gruppo)                                                                                                      

1)S.alactolyticus  - infezioni suine

                                                                                                          

Herrera & Coll.(2000) aggiungono alla tabella  alcune delucidazioni indispensabili. Secondo questi ricercatori i ceppi di S. bovis appartenenti ai clusters DNA I e II possono essere classificati ulteriormente in due biotipi  in base allo loro capacità (biotipo I) o incapacità (biotipo II) di fermentare il mannitolo. Il biotipo I idrolizza i tannini e decarbossila  l’acido gallico (Sli & Coll.(1997). I ceppi del biotipo II possono essere divisi in due subtipi: biotipo II.1 beta- glucuronidasi negativo e beta-galactosidasi positivo, mentre il biotipo II.2 beta-glucuronidasi e beta e beta-mannosidasi positivo. S. bovis  biotipo II.1 e S. equinus fanno parte del cluster DNAI (Schlegel& Coll. 2003). L’elevato grado di ibridizzazione DNA-DNA e la somiglianza delle sequenze del 16S DNA (99,0%) rivelano che S. bovis e  S. equinus sono una sola specie.                                      

 Gli streptococchi del DNA cluster II possono essere isolati da infezioni umane, mastiti bovine e formaggi comprendono S. bovis biotipo I e II,2,S.galloliyticus ed S. macedonicus (Osawa & Coll.(2004). Ulteriori analisi delle sequenze del DNA di questi ceppi suggeriscono che il cluster sia composto da una sola specie (S.gallolyticus) con tre sottospecie (gallolyticus, macedonicus e pasteurianus).                                  

La  sub specie gallolyticus è caratterizzata dalla fermentazione del mannitolo e dalla presenza degli enzimi tannasi e gallato decarbossilasi (Sli & Coll.1997). Questa sottospecie consiste di  ceppi di S. bovis biotipo 1 che sono stati associati con endocarditi e cancro  del colon (Schlegel & Coll.2003; van’t Wout & Co   ll.2005). Questa sottospecie comprende anche S. caprinus che è solitamente isolato isolato dai ruminanti è possiede una elevata tolleranza ai tannini (Brooker & Coll.(1995).La sottospecie macedonicus è stata isolata, talvolta, da infezione animale e sovente da prodotti del latte formaggi, latti fermentati e vegetali fermentati). La sottospecie pasteurianus consiste  di S. bovis  biotipo II.2  che è spesso isolato da malattie umane (endocarditi e infezioni del tratto urinario).                                                        

 Il cluster DNA  III  consiste di S.infantarius che è composto da due sottospecie: coli e infantarius. Questa specie è stata isolata da prodotti alimentari e da infezioni umane, come la malattia sistemica degli infanti.                                                                                    

Il gruppo DNA IV è composto  da S. alactolyticus causa di infezioni nei suini. 
E’ la sola specie del complesso bovis equinus incapace a fermentare il lattosio.                                                                                

Possibilità di diversità  tra lespecie di S.bovis isolate da essere umani, animali e alimenti. E’ stato reso noto che ceppi di S. bovis  sono presenti nel 10%  nella popolazione batterica intestinali degli individui sani e nel 29 %-55 % degli individui di soggetti affetti da infiammazioni  intestinali e cancro del colon,quindi la presenza di S, bovis in pazienti umani, in animali e in alimenti hanno determinato la necessità di verificare la corrispondenza dei ceppi delle specie isolate da animali e alimenti con quelli  responsabili di patologie negli umani. Purtroppo i test biochimici a nostra disposizione non sono in grado di  offrire diagnosi esatte per l’ampia varietà di fenotipi costituenti il complesso S.bovis/gallolyticus rendendo necessario ricorrere all’uso di metodi biomolecolari per la loro distinzione. Inoltre in diversi i clinici umani si sono serviti solo dei test biochimici limitando la designazione dei ceppi isolati ai soli Biotipi I e  II. I ricercatori che hanno affrontato questa problematica sono pochi, precisamente Whitehad & Coll. (2000) e  Kutovic & Coll.(2003).Questi ultimi hanno valutato la capacità di ceppi umani e bovini di crescere in presenza  di lisozima riscontrando che i ceppi bovini sono da quattro ad otto volte più suscettibili al lisozima rispetto ai ceppi isolati dagli umani. La maggior parte dei ceppi bovini saggiati sono stati inibiti da o,13 mg di lisozima per ml^-1, Anche i ceppi più resistenti non crescevano in presenza di concentrazioni di lisozima maggiori a 0,5 mg/ml^-1.  Comunque i ceppi bovini  riuscivano resistenti al lisozima dopo essere stati sottoposti a dosi sub letali di lisozima (0,06 mg/ml^-1..(Kurtovic & Coll.(2003).                                    

L’inibizione della crescita dei ceppi bovini risultò aumentata con la sostituzione del glucosio nel terreno di crescita con il 2-deossiglucosio (2mg/ml).Misurando col turbidometro l’intensità di crescita dei ceppi umani e bovini si osservo una intensità di sviluppo dei ceppi bovini dieci volte inferiore a quella dei ceppi umani dopo 48 h di incubazione nel terreno di crescita. Questi risultati  hanno indotto Kutovic & Coll.2003) ha proporre  aggiungere lisozima e 2-deossiglucosio nei terreni utilizzabili per   l’isolamento dei ceppi di origine umana.  

                                                                                

Importanza delle specie principali umane del complesso S.Bovis/S.equinus e attività patogena.                                                                                                                                                  Nella tabella n.2 sono riportate le principali specie patogene per l’essere umano e la realativa nomenclatura.                                                                                                                                    

Tabella n.2 specie patogene per l’essere umano del gruppo S.bovis/S.equinus           

Nuovo nome - Prima designazione fenotipica - Sinonimi

Streptococcus gallolyticus - S.bovis biotipo I - S.gallolitycus - subsp.gallolyticus 

Streptococcus infantarius -S.bovis biotipo II/1 - S.infantarius - subsp. infanatarius 
S.infantarius subsp.coli - S.bovis biotipo II/1 - Streptococcus QQLutiensis 
S.gallolyticus subsp. - S.bovis biotipo II/2 - Streptococcus pasteurianus - pasteurianus                         

(Boleij & Coll. 2011)                                                                                                                                                                                     --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

L’attività patogena dei ceppi del S.bovis/S.equinus group è un processo complesso.           

Secondo Herrero & Coll. (2002) gli streptococchi aderiscono alla mucosa intestinale  stimolando la produzione di citochine con conseguente vasodilatazione aumentando la permeabilità capillare permettendo così ai batteri di entrare nel  flusso sanguigno,di diffondersi ad altri organi e di moltiplicarsi con conseguenti necrosi tessutali. Recenti ricerche hanno individuato i fattori responsabili della virulenza (Lin & Coll.(2011), caratterizzando le fasi del processo infiammatorio che inizia  con l’interazione del microrganismo con le cellule ospiti variano dall’adesione ed interazione mediante il legame tra le proteine  e i polisaccaridi della parete batterica e i recettori delle cellule ospiti tessutali. Questa aderenza è fondamentale  èer la patogenesi dell’infezione. La superficie cellulare di S.gallolyticus è dotata di una varietà di proteine e di polisaccaridi in grado di creare legami covalenti e non covalenti con la parete del microrganismo. I componenti  della superficie  cellulare di S.gallolyticus possono essere divisi in quattro categorie: 1) LPXTG like proteins, 2) Pseudopili, 3) Lipoproteine di superficie, 4) capsula. Le funzioni di questi LPXTG contenenti proteine variano dall’adesione e interazione con la cellula ospite ,alla formazione di biofilms. Alla funzione di recettori  di antigeni,ad enzimi responsabili della virulenza. Altre proteine presenti sono le sortasi che sono fondamentali per ancorare i gruppi LPXTG alla cellula ospite. Molte delle proteine condivise fungono da trasportatrici, altre hanno attività enzimatiche quali: ribonucleasi, pullullanasi, proteinasi, e fosfo-N-acetilmuramoil-pentapeptiderransferasi.                                       

I pili batterici sono presunti fattori di virulenza e agiscono come  mediatori delle iniziali interazioni tra ospite e patogeno agendo come adesine in molti tipi di cellule epiteliali dell’ospite. I pili sono un insieme di fibre multimeriche   di proteine del complesso  LPXTG. Le lipoproteine fungono diverse funzioni: adesine, trasportatrici,  recettori, enzimi e fattori di virulenza (Sutcliffe & Coll.(1995).                                                

S.bovis/S.equinus group spp. in alimenti di origine animale e vegetale.                                      

Mentre dati sulla presenza di specie  streptococciche del gruppo S.bovis/ S.equinus nelle carni e nei prodotti derivati non sono rintracciabili, numerosi sono le ricerche riguardanti la presenza delle stesse nel latte crudo, nei latti e vegetali fermentati  e nei formaggi (Fortin & Coll.2000,Abdelgadir & Coll.2008,Amosum&Coll.2010,Jans & Coll 2012,2013. Queste ricerche hanno preso in considerazione l’isolamento e la identificazione di S.gallolyticus  subspecie macedonicus e  S.infantiarius e Sii specie.       

Lo  Streptococcus gallolyticus subsp.macedonicus è stato isolato per la prima volta nel formaggio a fermentazione naturale greco Greek Kasseri (Tsakalidou & Coll.1998) e, più recentemente, da altri formaggi Europei (Callon & Coll.2004;Lombar-di & Coll.2004;Poznanki &Coll.2004:Pacini & Coll.2006;Franciosi Coll,2009; Chebenova-Turkovska & Coll.2011). Georgalaki & & Coll. (2000)  hanno delucidato il suo ruolo nella maturazione del formaggio Kasseri concludendo che, per le sue capacità proteolitiche e per la bassa  proprietà acidificanti il latte, lo streptococco  difficilmente avrebbe potuto essere impiegato come starter primario nella maturazione del formaggio. Tuttavia, i ricercatori suggerirono il suo impiego come starter aggiuntivo  per la sua capacità di idrolizzare il grasso del latte e per la sua attività peptidolitica. Lombardi & Coll. (2004) sostennero tale proposta per l’esistenza di ceppi peptidolitici e per la sua capacità di produrre sostanze antibatteriche (macedocina) oltre a produrre esopolisaccaridi.                                    

Relativamente ai formaggi italiani Pacini & Coll.hanno condotto una ricerca per mettere a punto atto ad isolare e a quantificare il microrganismo in alcuni formaggi italiani tradizionali. S.macedonicus risultò presente nel 31,4 % dei formaggi esaminati Asiago e Fontina e assente in Ragusano, Pecorino, Moriacco e Vezzena. Nei campioni dei formaggi Asiago le concentrazioni riscontrate  risultarono comprese tra 2.48 e 7.13 CFU g^-1 e nel formaggio Fontina tra 3.48-3.78 CFU^-g^-1 Questi dati dimostrarono che S:macedonicus può essere isolato da diversi tipi di formaggi ma in essi non rappresenta  la specie predominante. Nella ricerca gli autori usarono due terreni per il conteggio di S. macedonicus il terreno M17  e un terreno messo a punto da loro,risultato più idoneo allo scopo denominato SM,così formulato: 33 gL^-1 CASF (Count agar Sugar free), estratto di lievito 2,5 g L^-1,0,5g L^-1 potassio ascorbato,0.015 g L^-1  bromocresolporpora. e 19 g l^-1 glicerolfosfato Dopo sterilizzazione a 121°C  fu aggiunto raffinosio 5g L^-1  sterilizzato con filtro Seitz Dopo insemenzamento le  piastre erano incubate a 44°C per 48 h.                                                  

Streptococcus infantarius supsp.infantiarius - recentemente è stato dimostrato altamente prevalente fra i batteri lattici (LAB)  nei prodotti del latte fermentati spontaneamente preparati con latte di bovina,capra e cammello in Mali, Sudan,   Kenia,Somalia e Tanzania ( Isono & Coll. 1994;Abdelgadir & Coll.2008; Jans & Coll. 2012:Wullschleger & Coll. 2013; Jans & Coll. 2013).Altre ricerche riportano la prevalenza dei membri del gruppo SBSEC in latti fermentati tradizionali e in vegetali fermentati in Asia (Bangladesh).in Nord America (Messico) (Diaz-Ruiz & Coll. 2003;  Rashid & Coll.2007) Renye  Coll.2011).                                                                                           

Campioni di latte bovino,di capra e di cammello sono stati esaminati da Jans  & Coll. (2013)per valutare la presenza di specie di appartenenti al gruppo  SBSC   nell’Est ed Ovest Africa. Lo Streptococcus infantarius subspecie infantarius risultò la specie prevalente,Altra specie minoritaria numericamente fu lo Streptococcus gallolyticus  subsp.macedonicus. I conteggi medi dei due lattici nei latti esaminati ( valutati con l’uso dei terreni M 17 e SM  agar) risultarono compresi tra 1,6+/- 2,0 log₁₀ e  5,6+/- 1,1 log₁₀ CFU/ml  e  2,6+/- 1,2  fino a 3,9 +/-1,1 CFU/ml. Con ampie variazioni queste concentrazioni  riscontrate campioni di latte bovino e di capra risultarono inferiori a quelle riscontrate nel latte di cammello nei quali le concentrazioni furono di 2,6 +/- 1,2 e 6,3 +/- 1,4 log₁₀ ,precisamente nel latte bovino le concentrazioni risultarono di  3,5 +/-1,8  e 3,8 +/-1,2 log₁₀ e in quello di capra 3,2 +/- 0,8 log_10i .Nei latti fermentati Suusac i conteggi furono  di 6,4 +/-0.9  e 7,3 +/- 0.9 log₁₀  e nei latti acidi da non rilevabili a 6,6 +/-0.0 log ₁₀-                                                                                                

Contrariamente  al ceppo Sii classificato nel gruppo a rischio elevato,i ceppi Sii africani  posseggono un diverso fenotipico e genotipico metabolismo del lattosio.    Infatti i ceppi Africani metabolizzano il lattosio del latte  con il sistema enzimatico LacS/LacZ mediato simile a quello dello S.thermofilus (Jans & Coll 2013).Tuttavia le relazioni tassonomiche con i membri patogeni degli SBSEC e le implicazioni con le endocarditi (Giannitsioti & Coll.2007) richiedono  metodi diagnostici idonei per identificare i ceppi virulenti.      

Riassunto                                                                                                                                                        

In questo articolo  sono state riportate la  tassonomia attuale delle specie facenti parte dello Streptococcus bovis /Streptococcus esquinus (SBSEC group) e le specie ritenute principali patogene per l’essere umano.Sono stante anche riportate la loro presenza e  concentrazioni riscontrate in prodotti a base di latte Europei ed Africani Summary.

In this text the actual taxonomy of S.bovis/S.equinus group and the principal pathogenic species for human have been signaled.Their presence and concentrations in European and African Dairy products, have been also,reported,

BIBLIOGRAFIA                                                                                                                                      

Abdelgadir W,Nielsen D,S;Hamad S: & Coll.(2008) Int:J: FoodMIcrobiol.127,215-219 Abou Younes A,E.(2013)

Jordan  J.Agr.Sci. 9, 249-257 Amosum E.A.;Ajuwape A.T.P;Adetosoye A.I. (2010)

 Afr.J.Biomed.Res. 2,33-37                                                                                      

Boleij A.;Muytiens C.M.J.:Bukari S.L: & Coll. (2011) J.Inf. Dis.203,1101-1109                             

Boleij A.;van Gelder M:M:Hj:;Swinkels D. W: % Coll.Comm.Inf.Dis.(2011) %3,870-877                           

Callon C.;Millet J.;Montel M.C. (2004) J Dairy Res.71,231-244                                                     

Brooker J.D.; Lum D.K.; Thomson A.M: & Coll.(1995)Lett.Appl.Microbiol.21,292-297                                            

Chebenova-Turcovsk V.;Zenisova K.; &Coll. (2011) Int.J.Food Microbiol.150,73-78

 Diaz-Ruiz G.; Guyot J.P.: Ruiz-Teran F: % Coll. (2003) Appl.Env.Microbiol. 69,4387-4374.                                                                                                                                                                   

Fortin M.;Messier S.; Parè J.& Coll ,(2003) J.Clin.Microbiol. 41,106-109        

Franciosi  L.; Settanni L.; Cavazza .& Coll.(2009) Int.Dairy  J. 19,3-11 

Georgalaki  M.D.; Sarantinopoulus P.;Ferreira E.S: & Coll.(2002) J.Appl.Microbiol.88,817-825

Giannitsioti  E.; Chirouze C.; Bouzet & Coll.(2007) Clin.Microbiol.Infect.13,770-776  Herrera Y.P.;Min Kwon Y.;Ricke S.C. (2009) Anaerobe 13,44-54                                       

Herrero I.A.;Rouse M.S.;Piper K:E: & Coll, J.Clin:Microbiol, (2002) 40,3848-3850 Isono Y.:Shingu I.;Shimizu S. (1994) Biosci.Biotecnol.Biochem. 58,660-664                                  

 Jans C. (2011)Thesis.No19835:ETH Zurich.Zurich,Switzerland                                                            

Jans C.;Bugnard J.;Niage P.M.K. ; Lacroix C. & Coll.(2012) LWT FoodSci Technol.47, 371-379                                                                                                                                                        

Jans C.;Follador  R.;HochstrasserM:;Lacroix  C: & Coll.(2013)

BMC Genomics 14,200 Jans C.; Kaindi W.M.K.;Bock D. & Coll.2013) Int;J;Food Microbiol.167,185-195

 Kurtovic A.;Jarvis G.N..Mantovani  H.C. & Coll .(2003) J.Clin.Microbiol.41,3951-3954 Lancefield R.C. (1933)  F,Exp.Med. 57,571-595                                                                            

Lin I.H.;Liu T.T..Teng Y:T  & Coll.(2011) PloS One  6,1-14                                                                  

Lombardi A.; Gatti M.; RizzottiL.& Coll. (2004)Int:Dairy J. 14,967-976                                 

Osawa R.;,Sasaki E.(2004) J.Clin.Microbiol. 42, 4912-4913                                                              

Pacini F.;Cariolato D.;Andrighetto C.& Coll.(2006)FEMS Microbiol.Lett.261,69-73 Rashid M.H.; Togo K.;Ueda  M.& Coll.82007) World J.Microbiol.Technol. 23,125-133 Renye  Jr.J.A.; Somkuti G.A: Van Hekken D.L. & Coll. (2011) J:Dairy Sci.94,3311-3315  Schlegel L:; Grimont F.; Ageron E.& Coll.(2003)

Int.J.Syst.Evol.Microbiol.53,631-645 Tsakalidou E.;Zoidu  E.;Pot B. & Coll.(1998) Int:J.Syst. Bacteriol.48,519-527                           

Sutcliffe I.C.; Russel R.R.(1995)J.Bacterol.177,1123-1128                                                  

Sly L.I.: Cahill M.M.; Osawa R. & Coll.)1997) Int:j:Syst.Bacteriol. 47,893-894                                            

vant’t Wout  j.W.;Bijlmer H.A. (2005) Clin.Infect.Dis. 40,1070-1071                                        

Whitehead T.R.,Cotta M.A.(2000) FEMS Microbial.Lett.182,237-240                                  

Wullschleger S.; Lacroix C.; Bonfoh b B. & Coll. (2013) Int:Dairy Sci.29,28-35