Clostridium perfringens : ceppi cpe+ ceppi cpe- nelle carni e loro patogenicità per l’essere umano.

Carlo Cantoni, libero docente in Ispezione degli alimenti di origina animale, Milano  

                                                                                                                                                 

Clostridium perfringens è un batterio anaerobio (microaerofilo),gram positivo, sporigeno, con forma di bastoncino. Le spore sono ovali e subterminali.

I ceppi di C.perfringens producono un ‘ampia varietà di tossine (antigeni solubili) extracellulari. I tipi A,B.C.D,E, sono distinti in base alla produzione di quattro tossine extracellulari: alfa. beta, epsilon e iota (Petit & Coll.1999). Queste tossine non sono associate alle patologie gastrointestinale degli umani.  

                                                                                                                                             Nella tabella 1 seguente sono riportate le varie tossine.

Tab. n .1 Tossine Tossine prodotte da ceppi di C.perfringens

                                                                                                                                     

Tossina letale (tipi)	Attività della tossina
Alfatossina (A,B,C,D,E.)	letale,necrotizzante lecitinasi C emolitica
Betatossina (B,C)	letale necrotizzante
Gammatossina (B,C)	letale
Deltatossina (B,C)	emolitica,letale
Epsilontossina (B,)	letale,necrotizzante attivata dalla tripsina
Eta-tossina (A)letale	(validità discutibile)
Thetatossina (A,B,C,D,E)	emolitica,letale,labile all’ossigeno
Iotatossina (E)	letale,necrotizzante attivata dalla tripsina
Kappatossina (A,C,D,E)	collagenasi,(letale,necrotizzante,gelatinasi)
Lambda-tossina (B,D,E)	proteinasi (disintegra Azocol e polvere di pelle)
Mu- tossina (A,B,D)	ialuronidasi
Neuroaminidasi	altera i recettorisperficiali ganglosidici trombosi
Nu-tossina (A,B,C,D,E)	desossiribonucleasi
Enterotossina (A,C,D)	complessa  la membrana plasmatica

I tipi A,C,D sono patogeni per l’essere umano, I tipi B,C,D,E e, forse, A sono patogeni per gli animali. La enterotossina prodotta dai tipi A e C è distinta dalle esotossine ed è responsabile di intossicazioni  alimentare e di altre gastroenteriti.

                                                                                                                                                  

Fonti ed habitats 

C. perfringens è ubiquitario nell’ambiente ed è stato isolato dal suolo, dalle polveri, da materie prime alimentari (specialmente da spezie) e dall’intestino degli esseri umani ed animali. Di conseguenza è possibile trovarlo negli alimenti carnei. Comunque un gran numero di ceppi di Clostridium perfringens presenti nelle carni è cpe negativa, cioè non è produttore di enterotossina. (Saito 1990).                                                         

C. perfringens è stato isolato nel 36%,80 % e 2% nelle feci di bovini, polli e suini, rispettivamente, il microrganismo è stato trovato nel 29%,60 %,e 35% nelle carcasse bovine, suine ed ovine. Per le carni di pollo un recente lavoro di Guran& Coll.(2013) riporta la presenza del 66% e 80%  nelle carni di polli allevati in Turchia; non si hanno dati sulla contaminazione delle carni di polli allevati industrialmente in Italia.

Gli episodi di intossicazione alimentare causati da C. perfringens sono conseguenti all’impropria cottura dei cibi a livello casalingo e nelle mense per collettività. La maggioranza delle intossicazione si deve alle carni di pollame e di suino mal cotte (arrosti di tacchino, porchette, salsicce ed altri tipi di prodotti carnei.                                               

I valori D delle spore di c,perfringens sono: 

                                                                                                                                                       tab.2

temperatura	Valori D (minuti)
100	da 0,31 a17,5
105	da 5 a 27,6

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                           

Patogenicità di Clostridium perfringens.

Mentre tutti i tipi di tossina riportati nella tab.1  sono ritenuti virulenti, solo i tipi A e C si sono res responsabili di malattie gastrointestinali umane come l’intossicazione alimentare, la diarrea associata a trattamento con antibiotici (AAD),la diarrea sporadica, la diarrea nosocomiale, la sindrome della morte improvvisa del lattante (Lindstrom & Coll.2014)

                                                                                                           

Intossicazione alimentare.                                                              

L’intossicazione alimentare da C. perfringens è causata da una enterotossina (CPE) codificata dal gene cpe e prodotta da meno del 5 % dei ceppi  di C. perfringens tipo A (Smedley & Coll.2004). E’ un polipetide singolo di 35KDa; si sviluppa dopo l’ingestione di alimenti contaminati con un numero elevato (>10⁶ ufc/g) di cellule vegetative cpe. I ceppi di C. perfringens  crescono a temperature tra 15°C e 54°C (de Jong & Coll.2004,Juneja & Coll.2006) e la temperatura ottimale di crescita è  sopra i 40°C La crescita è rapida nelle condizioni  ottimali  con un tempo di generazione di 7 minuti -8 minuti a 45°C.A 33°C il tempo di generazione  è di 19,5 minuti

Nella tabella n 3 sono riportati in dettaglio  alcuni tempi medi di generazione di C. perfringens a diverse temperature

                                                                                                                                                                                               Tab. n .3 Tempi medi di generazione di C.perfringens a diverse temperature.

Temperature (°C)	tempo medio di generazione
10	no crescita
16	6h
21	2h
32	23 minuti
46	8 minuti
50	3 h

Quando esistono le condizioni ottimali per la crescita di C. perfringens nei cibi contaminati con spore di cpe C. perfringens  raffreddati  lentamente o mantenuti e serviti a temperature comprese tra 20 e 50 °C, si verifica la loro germinazione con rapida moltiplicazione delle cellule vegetative di C. perfringens (Li & Coll.2006). Dopo l’ingestione di un grande numero di cellule vegetative, esse sporulano di nuovo nell’intestino elaborando CPE (Mc Lane 2001).                                                                                                                                             

Il gene dell’enterotossina può essere localizzato nel cromosoma batterico o su un grande plasmide (Cornillot & Coll.1995,Brynestad  & Coll.1997,Miyamoto & Coll.(2002) con posizionamento genetico in loci differenti nel cromosoma e nel plamide. (Brynstead&Coll. 1997) Nuovi cpe genotipi associate a strutture genetiche in via di identificazione sono state identificati (Heikinheimo& Coll.2006.Li & Coll.2006b)

L’espressione cpe  dipende dalla sporulazione (Harry & Coll.2009). Nell’ileo umano CPE agisce come una tossina formante pori causante danni e perdita di trasporto di sostanze. A secondo della quantità di CPE elaborata, i livelli cellulari di calcio possono aumentare rapidamente e le cellule intestinali muoiono per apoptosi o per via oncotica (Smedley & Coll.2004), si manifestano quindi crampi addominali e copiosa diarrea. L’analisi genetica dei  ceppi di C.perfringens cpe positivi ha evidenziato che i ceppi con cpe localizzati nel cromosoma formano un gruppo (cluster) omogeneo e distinto dagli altri ceppi di C. perfringens.(Keto-Timonem & Coll.2006,Deguchin & Coll.2009). Viceversa i ceppi cpe positivi  con gene nel plasmide sono diversi e condividono similitudini genetiche con i ceppi di C. perfringens cpe negativi (Keto-Timome & Coll.2006,Deguchi & Coll.2009). Considerando le differenti genetiche, il tipo di malattie  prodotte e la differente resistenza ai fattori ambientali, risulta evidente che i clostridi con cpe nel cromosoma e quelli con cpe nel plasmide sono epidemiologicamente distinti (Lindstrom & Coll.(20014). Mediante l’analisi genetica di ibridazione con DNA microassay e all’esame del metabolismo di acidi grassi e dei fosfolipidi, sembra accertato che i ceppi con  cpe nel plasmide sono presenti 

nell’ambiente intestinale prevalentemente, mentre i genotipi con cpe cromosomiale siano presenti o associati anche ad altri ambienti (Lathi & Coll.2012).          

Il paziente

Crampi, dolori addominali e diarrea compaiono dopo 12 ore dall’ingestione delle cellule di C.perfringens Casi  di mortalità sono rari ma si possono manifestare a danno di esseri umani in tarda età o debilitati (Smith 1998,Bos & Coll.2005). I ceppi con pce cromosomiale per lungo tempo sono stati ritenuti responsabili di intossicazioni alimentari (Sparks & Coll.2011). Ciò era attribuito ad una maggiore resistenza agli stress dei ceppi cromosoma cpe positvi. Tuttavia recenti ricerche hanno confermato che anche ceppi cpe plasmide positivi sono pure presenti negli alimenti (Tanaka & Coll.2003,2007,Grant & Coll.2008.Lathi & Coll.2008) sono responsabili di intossicazioni alimentari.                                                                                                                                 Oltre alle intossicazioni, i ceppi cpe-positivi di C. perfringens tipo A sono stati riconosciuti causa del  di 15% di  casi di AAD e di diarrea sporadica SD nell’essere umano( Modi & Coll. 2001,Ashab & Coll.2002).Queste patologie sono state attribuite a ceppi di .perfringens plasmide cpe positivi non presenti nei cibi. Comunque, Lindstrom & Coll,(2011)sulla base delle attuali conoscenze e sui dati sperimentali clinici di Lahti & Coll.2008) ritengono certo che alcuni casi di ADD e di SD possono essere trasmessi col cibo.

Identificazioni dei ceppi di C.perfringens nelle feci e in alimenti

Come si è prima descritto l’intossicazione (avvelenamento) da C.perfringensvsi sviluppa dopo l’ingestione di alimenti contaminati con un elevato numero di cellule vegetative CPE-positive (= o> 10⁶ufc/g),Queste cellule, quindi, sporificano nell’intestino e producono CPE. Le feci delle persone ammalate contengono un ampio numero di spore di CPE-positivi C.perfringens (>10⁶ ufc/g). Per sapere che il C.perfringens sia di una l’agente di una intossicazione si deve ricorrere alla sierotipizzazione o prove di bgenotipizzazione molecolare come la PFGE, la nested PCR,l a PCR real time, la LAMP Assay (Miyamoto & Coll.(2012)

Episodi di intossicazione                                                                                                      Non si hanno a disposizioni dati  sul numero complessivo di intossicazione da alimenti contaminati con C.perfringens.T uttavia si ritiene attendibile un centinaio di casi annui, quindi una patologia molto ridotta. Ad esempio, in Piemonte negli anni 2002 e 2004 si sono registrati 20 e 40 casi. Nel periodo 1988-2001 la Regione Emilia e Romagna ha prodotto 33 notifiche, Nel Lazio, nel 2001,sono stati identificati 3 casi di malattia. In Milano nel 2012 sono avvenute una trentina di intossicazione in strutture sanitarie in seguito al consumo di piatti di carne suina poco cotta  e tenuta lungo a temperatura ambiente. Attualmente si è a conoscenza di due casi nel Lodigiano (ristorante) e in Veneto, conseguente al consumo  di porchetta cotta al sangue. 

                                                                                                                                               

In conclusione per evitare avvelenamenti da cibi contaminati da ceppi enterotossici di C.botulinum si indicano gli alimenti  casualmente responsabili e le modalità di prevenzione.

Alimenti responsabili:                                                                                                                                                                                     

·         Il batterio  C perfringens contamina frequentemente le carni crude (bovine e particolarmente quelle dei volatili).

·         Gli alimenti disidratati come le spezie

·         Le carni cotte entro il loro succo (bolliti.in ragu, in casseruola costituiscono un eccellente terreno di coltura.

·         La carne bovina  in pezzi di grosse dimensioni 

·         Carne di volatili 

·         Altri tipi di carne, salse, legumi cotti    

                                                                      

Prevenzione:

·         Mantenere la carne al caldo prima di servirla a una temperatura superiore a 70°C.

·         Raffreddare rapidamente le carni cotte, precedentemente porzionate in pezzi di limitate proporzioni

·         Riscaldare sufficientemente gli avanzi delle carni prima di riservirle.

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MACCHIE E AMMUFFIMENTI SCURI SU CARNI E PRODOTTI DERIVATI

Carlo Cantoni, libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale, Milano

Stefano Ibba, Medico veterinario AST Sondrio

Sebbene raramente, talvolta su carni e prodotti carnei si evidenziano macchie scure localizzate o diffuse prodotte da miceti o da batteri. Le prime segnalazioni in proposito si devono a Leistner & Coll (1968,Gill 1981).e sono state attribuite a miceti, precisamente a Cladosporium herbarum, Cladosporidium cladosporoides, Penicillium hirsutum, Aureobasi-dium pullulans, Mucor mucedo, Penicillium glaucum, Rhizopus nigricans, Rhizopus stoloniferum, Scopulariopsis (Dikeman & Coll.2014), sviluppatisi sulle superfici di carni bovine e ovine.

Le prime segnalazioni di ammuffimenti  sulle superfici di prodotti  di carne suina e del loro tessuto adiposo si devono a  Hughas & Coll,(1987,1988), Arnau(& Coll.1993). Dalle macchie  furono isolati i batteri responsabili dell’annerimento che furono identificati come specie nova  denominata Carnimonas nigrefaciens da Garriga, Ehrman, Arau, Hughes

Le caratteristiche proprie di questi microrganismi sono state così descritte: batteri Gram  negativi, asporigeni con forma di bastoncino diritto leggermente incurvato. Osservati al microscopio appaiono soli o appaiati, immobili, ossidasi e catalasi negativi. Le cellule batterica sono obbligatoriamente aerobie e sono alofili moderati. In presenza dell’8 % di sale non si sviluppano. La loro temperatura ottimale di crescita è di 28-30 °C. Non crescono a 5°C e a 37°C, Le colonie non sono pigmentate, bianche, lucenti, circolari. Producono acido da glucosio, fruttosio, maltosio, xilosio, melobiosio e saccarosio.

Non idrolizzano la gelatina, la caseina, il DNA. Sono Voges-Proskauer negativi anche argininidrolasi, ureasi, lecitinasi e fenilalanina negativi. Non producono indolo e non riducono i nitrati. Sebbene le colonie non siano pigmentate, questi ceppi reinoculati formano  macchie scure.

La loro posizione tassonomica attuale li pone nel genere Carnimonas, famiglia Halomonadaceae, ordine Oceanospirillales, classe Gammaproteobacteria, Philun Proteobacteria.

                                                                                                                    

La famiglia delle Halomonadaceae comprende batteri marini moderatamente alofili ed  è quindi ipotizzabile che i Carninomonas lo siano.

Krockel (2009) ha isolato ceppi di Pseudomonas fluorescens alotolleranti moderati da carcasse, grasso e da prodotti carnei  suini (prosciutto e pancetta) responsabili della formazione di macchie scure sulle loro superfici, ritenendole dovute alla produzione di melanina. 

Le melanine sono un gruppo di macromolecole sintetizzate ubiquitariamente negli organismi viventi, durante il loro sviluppo, in seguito all’ossidazione e polimerizzazione di varie sostanze fenoliche. Questi  composti agiscono come fotoprotettori dai raggi UV e dalla luce visibile. Catturano i radicali liberi, sono antiossidanti.                                                          

In genere le melanine hanno carica negativa, sono idrofobiche e hanno un elevato peso molecolare e hanno strutture amorfe. Sono insolubili nei comuni solventi organici, nelle soluzioni acide acquose e nell’acqua.                    

In base al loro colore e struttura primaria  vi sono tre tipi di melanine: le eumelanine, le feomelamine e le allomelanine: le eumelanine sono di colore rosso-marrone, le feomelanine sono marroni-gialle o rosse. Queste sono presenti nelle specie animali, mentre le allomelanine (di colore nero) si trovano nei microrganismi e nei vegetali (Coyne,& Coll.1992).                                                                      

Alcune melanine sono prodotte da miceti (p.e.Cryptococcus neoformans, Sporothrix schenkii, Aspergillus niger, Penicillium marneffei, Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatus (Coyne  & Coll.1992) 

Batteri produttori di melanina sono: Aeromonas salmonicids, Azotobacter, Micobacterium, Legionella, Vibrio, Proteus, Azospirillum, Pseudomonas aeruginosa, Hipomonas sp., Burholderia cenocepacia, E.coli, Bordetella pertussis, Campylobacter jiejunii, Yersinia pestis e Bacillus cereus, Bacillus thurigensis mutante, Klebsiella,Azotobacter crococcum, Brevundimonas (Coyne & Coll.1992,:Suzwase & coll,2013; Zerrad & Coll.2013)

Nel genere Pseudomonas oltre a  certi ceppi di Pseudomonas fluorescens possono produrre melanina anche Pseudomonas putida e Pseudomonas stutzeri.Pseudomonas balearica e Pseudomonas guinea.

Ceppi produttori di melanina riconducibili a Pseudomonas fluorescens sono presenti nelle alghe e nelle acque marine (Tarangini & Coll.(2013).Questi ceppi crescono tra 25 e 42 °C,ad un pH compreso tra 6 e 11.Non sono ceppi psicrotrofi e probabilmente sono presenti in acque marine calde. Nella tabella seguente (tab 1) sono riportate le caratteristiche del gruppo:                                                                                                                

Tab 1 Caratteristiche di ceppi maini di Pseudomonas fluorescens produttori di melanina:

Colonie: circolari ,lucenti ,con margini interi continui

Colorazione di Gram: Gram negativi 

Temperatura di crescita: 25-42 °C

pH di crescita:6-11 

Crescita in presenza di NaCl: 0,5- 6 % 

Catalasi, Ossidasi: positivi  

test di Voges Proskauer: negativo

Idrolisi della caseina: negativa 

Citrato: positivo

Riduzione nitrato :negativa

Arginindiidrolasi, idrolisi gelatina, idrolisi amido, idrolisi esculina: negative

Tween 20,40,60,80 idrolisi positiva, 

Idrolisi DNA: negativa

Acido da glucosio, fruttosio, maltosio, saccarosio, destrosio e raffinosio. :positiva

Acido da cellobiosio, trealosio, dulcitolo: negativa. 

Per il loro isolamento e pronto riconoscimento di produzione di melanina i ceppi devono obbligatoriamente coltivati su Marine agar Difco e simili. 

Andrade & Coll./2012 in una ricerca effettuata per conoscere le cause della presenza di macchie nere sulla superficie di Prosciutto iberico hanno isolato ed identificato un batterio Gram negativo, ossidasi positivi il quale in base alle prove biochimiche API 20 NE e alle analisi filogenetiche basate sui geni carA del 16SRNA è stato  riconosciuto come Pseudomonas fluorescens. Inoculato in grasso suino di prosciutto sterile provocava annerimento in presenza di substrati non salati con Aw di 0.94 4 e 0,97; il ceppo era psicrotrofo, non cresceva 37°C.

In base alle caratteristiche degli Pseudomonas causa di annerimento, i ceppi isolati dai prodotti carnei, compresi Ps.stutzeri e Ps.putida appartengono al gruppo degli psicrotrofi. probabilmente derivanti dalle acque, produttori di melanine mentre in natura esistono ceppi  di Pseudomonas florescens di origine marina anch’essi produttori del pigmento presenti in acque salate di mari  temperate e non psicrotrofi. 

In aggiunta Pseudomonas libanensis è stato segnalato come responsabile di macchie blu  sviluppate sulla superfice di prosciutti crudi (Cantoni & Coll.2001).

Annerimento da muffe,                   

Scarse ricerche sono state pubblicate su muffe responsabili di annerimento o di chiazze nere sulla superficie di prodotti carnei. Sono state descritti ammuffimenti da Mucor plumbeus, Mucor brunneogrigeus,e Cladosporium oxysporum. I primi due sono stati isolati da superfici da prosciutti crudi. Le Mucor spp. appartengono al genere Mucor, famiglia: Mucoraceae, ordine Mucorales, subphylum Mucormicotina, phylum Phycomicota ,Regno Fungi. L’ammuffimento di un salume spagnolo “salcichon “ è stato descritto da Lozan-Ojalvo & Coll. 2015) ed  è stato  provocato dallo sviluppo superficiale di Cladosporium oxisporum. La muffa fa parte del genere Cladopsorium, famiglia Davidiellacea, ordine Capnodiales, classe Dothydeomycetes, phylum Ascomiceta. (foto 7,8)

La principale via di diffusione delle muffe è rappresentata dall’ambiente esterno in funzione della stagione, clima e zona geografica. In campagna la contaminazione ambientale è prevalentemente sostenuta da  Alternaria, Cladosporium e ad Aspergillus ochraceus, In ambienti abitati sono presenti Aspergillus e Penicillium spp.

Altre fonti di contaminazione sono :

- gli imballaggi (carta, cartoni, materile plastico

- soffitti, pareti, piarele, infrastrutture in legno e altri materiali porosi  

- sistemi di filtrazione dell’aria

- personale                                                                                                                                                   

Per eliminare la presenza di muffe e loro spore negli ambienti d lavorazione dei prodotti carnei è opportuno utilizzare l’ozono. Questo è un gas con forte potere ossidante e, a livello cellulare, ossida le biomolecole, sia direttamente che indirettamente (Kadre & Coll.2001). L’ozono in presenza di umidità si decompone rapidamente dando origine ad una serie di specie reattive dell’ossigeno (ROS), quali l’anione radicale superossido (O₂^.:-)., il radicale idrossilico^{. (}HO^.) ed il perossido d’ossigeno (H₂O₂) che causano alterazioni della struttura  e funzioni delle macrolecole biologiche (lipidi, aminoacidi) (Laisk & Coll.1989;Sarti & Coll.(2002), Serra R. & Coll.(2003)

Nel settore dei prodotti carnei oltre alle muffe col trattamento con ozono è possibile iiberarsi di insetti 

Per effettuare l’eliminazione di muffe ed insetti si possono adottare i parametri qui indicati                                                                                                                                                 

Tab 2.Inattivazione di muffe ed insetti con l’ozono

Organismo                                       concentrazione               tempo di esposizione 

Muffe 

Aspergillus niger, Penicillium,

Cladosporidium                                       2 ppm                                  60 minuti 

Lieviti                        

Candida spp.                                       0,02-0,26 ppm                       pochi minuti

Insetti

Acarus siro,Tyrophagus casei, 

Tyrophagus putrescientiae                      1,5-2 ppm                           30 minuti             

I tempi di trattamento dipendono la livello di contaminazione, anche alcune ore

                          

Summary 

Black patches on meat and meat products.

In the text are listed and described the bacteria spp and moulds which ha been resposable of black patches  formation on  raw meats and meat products
                                                          
Riassunto 
Nel testo sono elencati e descritti  I batteri e le muffe che hanno causato annerimenti sulle superfici di carni ve di prodotti carnei

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