Attività batteriostatica del nitrito nei prodotti carnei.

Carlo Cantoni, libero docente in ispezione degli alimenti di origine animale, Milano

Nitrato e nitrito sono normalmente presenti nelle diete venendo ingeriti da vegetali, acqua e prodotti carnei addizionati con questi composti per il loro effetto preservante ed antibatterico. L’attività antibatterica è svolta dal nitrito, e  da composti derivanti dalla sua dismutazione. Nei prodotti carnei il nitrito e i suoi metaboliti sono distribuiti come segue:                                                                                             

Tab.1 Nitrito e suoi metaboliti nei prodotti carnei additi vati (libero/legato) A) nitrito  5-20%; nitrato 1-10 %;  mioglobina  5-15%;  legato a gruppi –SH 1-15%; legato ai lipidi 1-15%;  legato alle proteine 20-30 %;  gas  1,5 % Totale circa 70 % (Cassens 1978).      

Dopo l’aggiunta nelle carni, il nitrito viene ridotto tramite reazioni di nitrosazione e nitrosilazione in presenza di alcuni fattori favorenti rappresentati dalla temperatura, composti endogeni ed altri ingredienti aggiunti (Cassens,1977). I composti che si formano dal nitrito sono biossido d’azoto, triossido d’azoto N₂O³, acido nitroso e monossido d’azoto (Honikel  2008 modificato). Alcun composti aggiunti intenzionalmente come l’acido ascorbico e il sodio eritorbato possono ridurre il nitrito liberando NO gassoso (Fox & Coll.1963). Anche  il cloruro di sodio può formare nitrossilalidi che aumentano la velocità di  formazione di acido nitroso nei prodotti carnei addizionati (Fox% Coll.1994;Sebranek & Coll  ). Il tessuto muscolare contiene composti endogeni in grado di ridurre il nitrito (Walters & Coll 1964). La emoglobina e la mioglobina riducono il nitrito tramite l’ossidazione dell’eme ferrico (Brooks 1937, Doyle &Coll, 1981, Shiva & Coll. 2007). La cisteina ed altri composti sulfidrilici possono formare S-nitrotioli in soluzione acquosa (Miersch & Coll.2005) e possono agire come agenti nitrosanti o possono rilasciare ossido nitrico (Williams 1999). Oltre queste attività, il nitrito ed i suoi derivati esercitano attività antibatteriche (Tompkin 2005). Dei due  conservanti il nitrato aggiunto viene ridotto a nitrito dai batteri. Questi risulta efficace nel contrastare batteri Gram positivi e Gram negativi, mentre non agisce su lieviti e muffe. L’esatto processo di inibizione non è chiaro. Il nitrito  è efficace in concomitanza con altri agenti come il sale, l’acidità del substrato (Sofos & Coll.1979), la refrigerazione e le condizioni anaerobiche del substrato carneo e dell’imballaggio per presenza di CO₂ che acidifica il prodotto carneo confezionato (Buchanan & Coll. 1989, Sofos & Coll. (1979).  L’effetto antibatterico del nitrito è stato studiato particolarmente per l’inibizione di Clostridium botulinum, C. perfringens  e in questi tempi per Listeria monocytogenes. 

                                             

CLOSTRIDIUM BOTULINUM. Prima dell’impiego del nitrito negli alimenti carnei erano comuni. Oggi sono praticamente assenti. Il C.botulinum è un batterio anaerobio, sporigeno, Gram positivo. Esercita il suo potere tossico tramite la produzione di sette tipi di tossine siglate con le lettere da A a G. Le intossicazioni da alimenti, da ferite (rare) e il botulismo intestinale sono causate dai tipi A, B, C, E e, in circostanze rare dal tipo F. Il botulismo negli animali è provocato dai tipi C, D, mentre il tipo G  non sembra tossico. (Montville & Coll.2005).  C. botulinum è stato pure diviso  in quattro gruppi in base alle caratteristiche fisiche dei ceppi componenti. Il  gruppo I comprende il tipo A ed i ceppi proteolitiici B e F. Il gruppo II contiene tutti i ceppi E e i ceppi non proteolitici B e F. Del gruppo III fanno parte i tipi C e D. Il gruppo IV  comprende i tipi G. Le C. botulinum spp. sotto forma di spore sono presenti nell’ambiente, soprattutto nel terreno, conseguentemente possono contaminare gli alimenti. Nella tabella n.2 sono riportati i gruppi e le caratteristiche dei ceppi di C. botulinum.

    

Tabella n 2 gruppi e caratteristiche di ceppi di C.botulinum

Caratteristiche tipo di neurotossine: A, B, F (gruppo I), B, E, F ( gruppo II), C, D (gruppo III), G (gruppo IV) temperatura minima di crescita  10°C (I gruppo), 3°(gruppo II), 15°C (gruppo III), 12°C (gruppo IV) temperatura  ottimale di crescita 35-40 °C (gruppo I), 18-25°C (gruppo II), 35-40°C (gruppo III), 35-40 (gruppo IV) Temperatura massima di crescita: 48°C (gruppo I);  45°C (gruppo II ); ND (gruppo III); 45°C (gruppo IV) pH minimo di crescita: 4,6 (gruppo I); 5,0 (gruppo II ); ND (gruppo III); ND ( gruppo IV) Aw  minima di crescita: 0,94 (gruppo I); 0,97 (gruppo II), ND (gruppo III); ND (gruppo IV) Concentrazioni inibenti di NaCl (%)  10 (gruppo I), 5 (gruppo II), 3(gruppo III), > 3 (gruppo IV) D_100C delle spore (min) circa 25 (gruppo I); < 0,1 ( gruppo II),ND (gruppo III;NA (gruppo IV) D_121oCdelle spore (min) O,21 (gruppo !);  < 0,005 ND: dato non disponibile                                                                                                                                                   

CLOSTRIDIUM BOTULINUMNEI PRODOTTI CARNEI. Sebbene diverse ricerche abbiano dimostrato una scarsa presenza negli alimenti (Jackson 2010) fin dal 1970 è stata constatata l’efficacia del nitrito di impedire la germinazione di C. botulinum. Il suo uso è utilizzato normalmente da tutti i produttori di carne alle dosi indicate dal Reg UE 1126.

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS. C. perfringens (C. welchii) è il termine di comune uso corrente. Il clostridio ò un batterio patogeno ( solo alcuni tipi), sporigeno, Gram positivo, anaerobio non stretto, le cui spore contaminanti gli alimenti del tipo A possono provocare intossicazione alimentare (vomito, diarrea). Le cellule di C. perfringens sono presenti allo stato vegetativo o come spore. Le cellule vegetative sono inattivate dalla temperatura di 75°C. Le spore del tipo A, sono resistenti al calore e possono sopravvivere a temperature elevate (100°C) e a basse temperature (15°C). C. perfringens è un patogeno opportunista ed è ubiquitario nell’ambiente. Questo patogeno può trovarsi nel suolo ( 10^3—10⁴ ufc/g), nel tratto intestinale degli animali (10⁵-10⁶ ufc/g) e saltuariamente nei prodotti carnei crudi e congelati (McLauclin % Coll.2007). La crescita di C.perfringens è ottimale a 43- 45 °C e il suo intervallo di crescita è compreso tra 15 e 50°C (Labbe 1989). Il Clostridio cresce  ma non a Aw di 0,95 (Strong & Coll.1970). Un pH del substrato di crescita tra 6-7 è ottimale per il suo sviluppo allo stato vegetativo e per la sporificazione. La crescita è inibita da pH % , la morte delle cellule si verifica a pH 5. Poichè il C. perfringens produce solo sette degli aminoacidi necessari per il suo sviluppo trovano i restanti nei substrati carnei i prodotti a base di carne sono quelli più implicati nelle tossinfezioni. Queste si manifestano quando il consumatore si ciba l’acidità dello stomaco uccide la maggior parte delle cellule vegetative, ma alcune sopravvivono e si propagano nell’intestino tenue ove inizia la sporulazione delle cellule con produzione di esotossine. Le spore aderiscono ai villi intestinali causando nausea e diarrea. Il riscaldamento, il raffreddamento impropri contribuiscono all’esplosione dell’intossicazione. Si sostiene che il nitrito inibisca la crescita di C. perfringens bloccando i siti sulfidrilici l presenti nelle cellule del patogeno (Tompkin 2005). L’effetto è di tipo batteriostatico e si esercita con altre specie di clostridi : per esempio, C.butyricum, C.tirobutiricum e C.sporogenes.

ATTIVITA' BATTERIOSTATICA NEI CONFRONTI DI ALTRI BATTERI. Generalmente il nitrito è ritenuto più attivo nei confronti di germi Gram positivi come Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes. Listeria monocytogenes è un bacillo Gram positivo che può crescere nel latte, soprattutto nei formaggi, in prodotti carnei cotti e nei prodotti ittici. Le listerie sono emolitiche (ceppi patogeni) e non emolitiche (ceppi non patogeni). Crescono aerobicamente tra 0 e °C e 50°C sopravvivendo nell’ambiente per lungo tempo. L.monocytogenes cresce in un intervallo di pH di 4,7-9,2. Il pH, la temperatura, e la concentrazione di nitrito sono i fattori più importanti per l’inibizione della sua crescita. Tali parametri sono indicati nel Reg.CE 2073 che tollera la presenza massima di 100 ufc/g in alimenti pronti per il consumo. Il nitrito esercita un’attività batteriostatica in unione con la temperatura, il pH e l’Aw (Sclyter & Coll.1983,Juntilla & Coll.1989, Mac Clure & Coll.1991,Mc Keller & Coll.1997,Kouaku & Coll.2009).

COMPOSTI DERIVATI DAL NITRITO CON CON ATTIVITA’ BATTERIOSTATICA. E’ ben noto che i composti batteridi e batteriostatici derivano da nitrito in ambiente acido. Il gruppo comprende:

1) l’acido di nitroso e gli N-nitrosocomposti, che possono diazotare e deaminare gli aminoacidi.

2) Il perossinitrito che si forma in ambiente aerobico in presenza di ossigeno. Il composto inibisce , C.sporogenes e L.monocytogenes

3) Complessi Fe-S-NO che si formano nei prodotti carnei cotti. I composti Ferro-zolfo-NO sono batteriostatici. Moran & Coll.(1975) hanno dimostrato la loro inibizione delle cellule vegetative di C.perfringes e delle spore di C.sporogenes.)

4) I nitroso tioli  e i composti  N-nitrosici, come l’anione nitrosocitoinilferrato, inibiscono Samonella spp, Streptoccus faecium, C.sporogenes (Incze & Coll.1974). Altri composti nitrosici riescono nocivi per Clostridiu e L.monocytogenes, come anche il monossido d’azoto, o ossido nitrico, che si forma dalla riduzione del nirito nei prodotti carnei, fermentati.  Banwart (1989) ha individuato quattro siti ove agiscono i nitroso composti : a) enzimi e altre proteine; b) il sistema genetico; c) le pareti cellulari o membrane d) il legame con nutrienti essenziali.

     

PRODOTTI A BASE DI CARNE E POSSIBILITA’ DI CRESCITA DI L.MONOCYTOGENES 

Augustin & col hanno eseguito una serie di prove sperimentali per verificare la possibilità di sviluppo di Listeria monocytogenes in 3 categorie di prodotti carnei; 1) prodotti cotti (prosciutti cotti, prodotti a base di carni di  pollo cotti, pates, rillettes, frankfurter cotti); 2) prodotti fermentati od essiccati (salami, prosciutti crudi, coppe); 3) prodotti in salamoia (hanno eseguito una serie bacon, dadi di bacon, salsicce). I singoli prodotti sono stati caratterizzati in base al pH, Aw, presenza di nitriti. La possibilità di crescita/non crescita fu eseguita mediante un challenge test., insemenzando elevate concentrazioni iniziali (ra 10² e 10³ ufc/g di prodotto), i campioni sono stati mantenuti a 4°e 8°C. Nei prodotti cotti la combinazione Aw e pH era di 0,956-0,980 e 5,80-6,55 rispettivamente. In tutti questi prodotti L.monocytogenes si sviluppò normalmente. Nel secondo gruppo di prodotti la combinazione pH e Aw furono di 4,63-6,1 e 0,831- 0,943 rispettivamente. In nessuno di questi composti si verificò crescita di Listeria monocytogenes. 3) la combinazione pH/Aw nei prodotti in salamoia era di 5,18-5,95 e di 0,939-0,975 rispettivamente.In questa categoria la crescita di L.monocytogenes si verifcò in 9 campioni su 35. La mancata crescita di L.monocytogenes nei prodotti in salamoia si ritenne dovuta alle particolari caratteristiche fisiche dei prodotti e dalle modalità del trattamento della salamoia. 

Ricerche analoghe su prodotti di salumeria italiani sono state condotte dal gruppo dei batteriologi della Stazione Sperimentale di Parma cordinati dalla Barbuti. I dati complessivi e le conclusioni sono stai pubblicati in una monografia della rivista Industria Conserve nel 2012. I campioni esaminati col challenge test sono stati: salami (cacciatore, Gentile, Salame Milano, Salame magro), prosciutto crudo, pancetta, bresaola, speck, culatello. In nessun campione L.monocitogenes crebbe. In sintesi, L.monocytogenes non trova condizioni favorevoli al suo sviluppo nei prodotti di salumeria a causa della combinazione pH/Aw/nitriti/lattobacilli nei prodotti fermentati e Aw/pH/cotenna nei prosciutti crudi.  

                                                

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Summary 

Nitrite and derivatives guarantee  the healthiness of meat products though bacteriostatic activities. The inibite pathogens are: C.botulinum, C.perfringens, Listeria monocytogenes, Salmonella spp and Staph.aureus. Others spoiling bacteria are  also inhibited.  

                                                                                                                        

Riassunto                                                                                                    

Il nitrito ed i suoi derivati garantiscono la salubrità dei prodotti carne mediante attività batteriostatica. I patogeni inibiti sono C.botulinum, C.perfringens, Listeria monocytogenes, Salmonella spp.e Staph aureus. Altri germi deterioranti (clostridia spp) sono pure inibiti.