BATTERI DEL BACILLUS GROUP NEGLI ALIMENTI

Carlo Cantoni, Libero docente In Ispezione degli alimenti di origine animale, Milano 

Salvatore Perillo, Medico Veterinario, Milano

Attualmente il gruppo Bacillus cereus comprende sette specie differenti. Alcune di loro sono causa di intossicazione e di tossinfezione alimentare che, nella maggioranza dei casi, i patogeni responsa-bili non vengono esattamente distinti con i tradizionali  metodi identificativi dovendosi,quindi ricorrere a specifiche tecniche molecolari. Per loro strette somiglianze fenotipiche e genotipiche potrebbero essere considerate una singola specie. I vari ceppi delle specie hanno un ampia variabilità patogena in quanto alcuni sono innocui ed altri sono tossici (Stenfors Arnesen & Cll.2008). Dati statistici degli episodi tossici sono difficilmente quantificabili perche possono manifestarsi con sintomi lievi risolti in 24 ore o in episodi di maggiore gravità.  Gli appartenenti al gruppo Bacillus cereus sono bacilli Gram positivi, sporigeni, mobili, aerobi, anaerobi facoltativi; sono normalmente presenti come saprofiti nei terreni e possono facilmente contaminare molti tipi di alimenti, specialmente vegetali, ma sono anche isolati da prodotti carnei, derivati di uova, latticini (Kramer & Coll.1989,Stenfors Arnesen & Coll.2008). Il B. cereus propriamente detto e altri componenti del gruppo causano due distinti tipi di intossicazione tossinfettiva : la diarrea e l’emesi (Kramer & Coll.1989). Il tipo diarroico è causato dal Bacillus cereus durante la sua crescita vegetativa nell’intestino tenue del consumatore (Stenfors Arnesen 2008). Almeno tre tossine sono responsabili insieme ad altri fattori tossici. Viceversa la tossina emetica è preformata nei cibi dal B.cereus moltiplicatisi in essi. La prima patologia  è quindi un’infezione, mentre la seconda è una intossicazione. In entrambi i casi le sindromi si manifestano dopo l’ingestione di cibi trattati col calore, con conseguente permanenza delle spore termoresistenti e con distruzione dei batteri termolabili. Il B.cereus non è un microrganismo competitivo, cresce bene dopo cottura durante la fase di  raffreddamento lento. Il trattamento termico provoca la germinazione delle spore e per l’assenza di batteri competitivi  si sviluppa velocemente. Il suo tempo di generazione è breve di 12-13 minuti (Borge & Coll.(2001). Le caratteristiche  dei due tipi di malattia sono riportate nella tabella  n 1.   

          

Tabella n 1 Caratteristiche dei due tipi di malattia causati da ceppi di B.cereus.                       

SINDROME DIARROICA:

1) n^o germi causa di malattia 10⁵-10⁷ (totale),

2) Tossina elaborata nell’intestino tenue).

3) tipo di tossina:emolisina,enterotossina NHe, HBl e Cyt K.

4)Periodo di incubazione ; 8-16 ore,occasionalmente >24 h.

5)Durata della malattia: 12-24 h (occasionalmente alcuni giorni)

6) Sintomi: dolori addominali, diarrea acquosa, occasionalmente nausea.

7) Cibi responsabili: zuppe, vegetali, budini, salse, prodotti lattiero caseari, prodotti carnei 

SINDROME EMETICA :

1) n^o germi causa di malattia:10 ⁵-10⁸ cellule/gr.

2) Produzione della tossina nell’alimento.

3)Tipo di tossina: peptide ciclico - Tossina emetica: cereulide.

4)Periodo di incubazione: 0,5-5 h.

5)durata della malattia 6-24 h.

6) Sintomi: vomito, malessere ( qualche volta accompagnato da diarrea in seguito alla produzione di enterotossina.

7) cibi responsabili: riso fritto, riso bollito, insalate di riso e di pasta, tagliatelle  

RICONOSCIMENTO DELLE SPECIE BATTERICHE. 

Come è stato prima citato  nel gruppo B:cereus sono comprese 7 specie strettamente correlate,  precisamente: Bacillus cereus sensu stricto, Bacillus anthracis, Bacillus thurigensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus weihenstephanensis, Bacillus cytotoxicus. Tutte  queste specie  non sono strettamente definite sulla base di divergenze genomiche ma su considerazioni soggettive ricavate da osservazioni pratiche come: virulenza(B:anthracis, B.thu-rigensis), fisiologiche ( B,weihenstephanensis), morfologiche (B:mycoides e B:paramycoides), e patologiche (B.cereus sensu strictu). Per una loro distinzione  Guinebretiere & Coll. (2008,2010) mediante tecniche biomolecolari hanno distinto nel gruppo 7  maggiori gruppi filogenetici (I-VII) evidenziando  ceppi mesofili (I,III,IV),  psicrotolleranti (VI,II) intermedio (V),termotolleranti (VII) in base alle loro temperature di crescita rivelando così la correlazione tra questi gruppi filogenetici  con la temperatura,il pH e l’attività dell’acqua (Aw). Tutti fattori che si impiegano per prevedere il il rischio di una specie batterica particolare per prevedere il rischio di essere causa di malattia da consumo di alimenti.     

PRECISAZIONI SULLE SPECIE PATOGENE.

      

BACILLUS  CEREUS. Come riportato nella tabella n 1 le malattie alimentari sostenute dai ceppi patogeni di B.cereus sono dovute alla produzione di due tossine: la emetica e un gruppo  di diverse tossine diarrogene (Chorin & Coll.1997; De Viries & Coll.2004). La tossina emetica, o cereulide, è un peptide ciclico termostabile. Non sopravvive nelle condizioni  dell’ambiente intestinale  e non causa diarrea, oopo avere agito viene inattivata dall’acidità del succo gastrico. Le enterotossine responsabili di sindromi diarroiche sono l’emolisina,,la enterotossina non come si verifica conemolitica e la citotossina. La parete cellulare  delle cellule vegetative di B.cereus sono ricoperte da proteine (S-strato) che favoriscono l‘adesione delle cellule  intestinali dell’ospite e la virulenza del microrganismo (Kotiranta & Coll.2000). La tossina emetica è stabile alla cottura e al reiscaldamento dell’alimento. La ceraulide rimane stabile a temperature fino a 150 ^oC e  fino a pH di 10,6 (Rajkovic & Coll.2008). La tossina ceraulide è assorbita dalla parete intestinale producendo nausea e vomito  stimolando le terminazioni nervose del nervo vago. L’ingestione di meno di  8 ug/Kg in un cibo provoca  l’emesi nel consumatore. La tossina, inoltre, colpisce i mitocondri danneggiandoli  e provoca l’apoptosi delle cellule killer umane (Paananen& Coll.2002). I ceppi mesofili di B.cereus a elaborano la tossina a temperature superiori a 10-15⁰C (Thorsen & Coll.2009). Ciò spiega perche la tossina esercita la sua azione  solo quando viene sintetizzata in alimenti conservate a   queste temperature da bacilli in  preparazioni di pasta e di riso. Le tossine diarroiche sono e  labili al calore: sono prodotte durante la crescita esponenziale dello sviluppo batterico. Poichè le spore di B:cereus sopravvivono al trattamento termico e all’acidità dello stomaco, i sintomi diarroici si manifestano quando le spore presenti nell’alimento giungono nell’intestino tenue. Qui germinano, le cellule vegetative si moltiplicano e   le tossine. I sintomi provocati dalle tossine di entrambi i due tipi di B.cereus si risolvono, normalmente, in  24-48  h, tuttavia in soggetti immunocompromessi o affetti da neoplasie o cachettici possono riuscire letali.  

BACILLUS WEIHENSTEPHANENSIS. Il bacillo si differenzia da B.cereus per la sua capacità di crescere aerobicamente a 7°C terreni liquidi, per l’impossibilità di crescita a 43°C (Lechner & Coll. 1998) e per la presenza nel genoma del gene cspA⁴ACAGTT (Lechner & Coll.1998). Altre ricerche hanno rivelato l’esistenza di altri ceppi biovarianti psicrotrofi con caratteristiche intermedie tra le due specie  testé citate. Secondo  Guinebretiere & Coll.(2008) il bacillo appartiene al gruppo IV con crescita a partire da  4-5°C. Il Bacillo può produrre la tossina emetica ceraulide a 8-10 °C ma non a 4°C (Thor-sen & Coll. 2006,2009). In proposito, sempre secondo Guinebretiere & Coll.(2010) solo i bacilli  appartenenti ai gruppi filogenetici III,IV,VII si sono resi responsabili di malattie alimentari.

BACILLUS  CYTOTOXICUS. Il Bacillo è stato isolato da cibi reidratati connessi ad episodi di intossica-zioni alimentari generalmente legati a consumo di alimenti  a base di patate  (Contzen & Coll.2014). E’ un microrganismo Gram positivo, facoltativamente anaerobio, di rapida crescita in ambiente aerobico, mobile. Le cellule hanno un aspetto simile a quelle del B¨cereus e si presentano  singole, appaiate, occasionalmente in brevi catene o con forma di filamenti. Le endospore sono posizionate  centralmente o subterminalmente in sporangi  rigonfi. La sua temperatura ottimale di crescita è compresa tra 30 e 37°C, la massima è di 50°C, la minima d 20°C. I ceppi sono lecitinasi e non idrolizzano l’amido (Guinebretiere & Coll.2013). Il bacillo non elabora cereulide e la sua patogenicità è attribuita alla attività citotossica  della citotossina K-1 (Cyt K1), la quale provoca la lisi delle cellule epiteliali dell’intestino tenue  con conseguente diarrea. ll bacillo appartiene al gruppo  fisiologico  VII della Guinebretiere (2010). Comunque non tutti i ceppi della specie sono citotossici (Fagerlund & Coll. 2007,2010). L’habitat del microrganismo  rappresentato dai vegetali,spesso è presente nei prodotti deidratati di patata  (granuli, fiocchi, farine) (Doan & Coll.2000; Turner & Coll.2006). La  dose infettante, riscontrata in una purea di vegetali,è risultata di 3,5 x 10⁵ spore/g (Lund & Coll.2000). La  presenza frequente di spore del bacillo nei prodotti  di patata disidratati potrebbe  rappresentare un possibile rischio (comunque raro) per i preparazioni tipo puree e simili dove è elevata per l’aggiunta di acqua  permette la germinazione delle spore e la moltiplicazione delle cellule vegetative.

ALIMENTI RESISI RESPONSABILI TOSSINFEZIONI DA BACILLI DEL B.CEREUS GROUP.   

A) ALIMENTI VEGETALI: puree di pisello e di altri vegetali, grano dolce, salsa di asparagi, salsa alla vaniglia, germogli di soia e di altri vegetali, tagliatelle cotte, riso bollito, piatti a base di riso (insalate), torta alla crema, frappè, dolci.

B)ALIMENTI CARNEI: carne con riso, distacca guarnita di Hibachi, pollo alla griglia, carne di suino grigliata, stufato, tacchino.

C) ALIMENTI  ITTICI: zuppe di pesce, patè di aragosta.

D) ALTRI ALIMENTI: uova strapazzate, cibi somministrati in mense scolastiche, (N.B.: trattasi di alimenti cotti. Elenco da Granum (2014) modificato).

CONCLUSIONI: Per controllare la crescita e lo sviluppo dei bacilli  si riportano, in sintesi, le condizioni  di crescita e di modalità di controllo di questi microrganismi:

A) CRESCITA:

1) Temperatura:Optimum 30-40°C,

2 )intervallo di crescita:4-55°C,i ceppi emetici crescono a 10 °C (Ehling-Schulz & Coll.2004)

3) Produzione massima di tossina a 20-25°C, intervallo di produzione 10-40 °C.

B) SOPRAVVIVENZA.

1)Temperatura: Le spore sono più resistenti al calore secco rispetto a quello umido e sono più resistenti nei cibi oleosi o grassi. La cottura al di sotto di 100 °C  permette la sopravvivenza delle spore (Van Asselt & Coll.2006). Le tossine emetiche rimangono attive dopo 150 minuti a 100 °C (valori di pH 8,7-10,6).

C) pH: ottimale 6-7; intervallo 4,5-9,5. In genere le cellule vegetative si riducono rapidamente nell’acidità dello stomaco, tuttavia alcune possano sopravvivere a seconda del tipo di alimento e dal livello di acidità del succo gastrico  (Clavel & Coll.2004). Le spore sono resistenti al succo gastrico (tra pH 1 e pH 5,2). La tossina emetica è stabile tra pH 2 e pH 9.

D) ATTIVITA’ DELL’ACQUA.

Minima,tra > 0,93 e < 0,95. Le spore sopravvivono per lungo periodo negli alimenti secchi,nei cereali più di 48 settimane Aw 0,27-0,28) (Jaquette & Coll.1998)

C) INATTIVAZIONE.

1)Temperatura: Le cellule vegetative sono distrutte da bollitura, frittura, grigliatura, cottura sottovuoto, arrostimento. Spore: D_100°C=1,2-7.5 minuti per il riso.D_120°C=2,5 secondi (Van Assalt & Coll.20O6). D_129*C= 3-4 minuti per cibi oleosi. La tossina emetica viene inattivata  dopo 90 minuti a 100 °C a pH 8,6. Le tossine diarroiche sono inattivate dopo 5 minuti a 56*C.

2) pH. Le cellule vegetative sono inattivate nello yoghurt (pH 4,5) nei succhi di frutta  (pH 3,7, 5- 6 log₁₀ ) di riduzione in poche ore secondo della temperatura.

3) Attività dell’acqua. Le cellule vegetative sono inbite da Aw< 0,91 

COMPOSTI  INIBENTI: le cellule vegetative sono inibite da acido acetico, ac.sorbico, acido benzoico, acido etilediaminotetracetico (EDTA) con polifosfati. Le spore e le cellule germinative sono inibite dalla lisina. Un pH di 4,2 impedisce la crescita dei bacilli nelle insalate di riso.

Concludendo,  per evitare episodi tossinfettivi  è necessario consumare a possibile rischio  dopo la loro cottura e nel caso di un loro consumo protratto occorre portarli a temperature inferiori a 10 °C  come dimostrato dai tempi di riproduzione delle cellule vegetative di Bacillus cereus riportate nella tabella n.2,risultante dai dati sperimentali di Mc Elroy & Coll. (2000) e di Penna & Coll.(2002).   

Tabella  n .2 Cinetica di crescita di cellule vegetative di Bacillus cereus   

 

Temp. 8°C)         Lag tempo (ore)         Tempo generazione in min.                        
10                                  120.0                           327.7 -5.45 ore                                    
15                                   9.1                              192.0 -3.2 ore                                      

20                                   6.7                              138.0-2 ore 

25                                   8.0                              59.0 -1 ora                         
30                                   2.1                              48

33                                   2.5                              42.3        

Nel caso di produzioni industriali  destinate a lunghi tempi di conservazione (30 gg) (insalate di riso) la temperatura non deve superare i  + 4°C. Infine secondo le Linee Guida del Regno Unito per gli alimenti pronti per il consumo (Gilbert &  Coll.; 2000) i criteri per valutare in numero di spore di B.cereus presenti in cibi pronti per essere consumati sono:

1) Soddisfacente < 10³/g.

2) Critico 10³<10⁴.

3) Insoddisfacente  10⁴<10⁵.

4) Inaccettabile > 10⁵ /g.      

RIASSUNTO.                                                                                                                                                                      Sono descritte le specie patogene  appartenenti al Bacillus group, la loro attuale tassonomia e le caratteristiche di crescita. Sono altresì indicati i  da attuarsi per evitare le sindromi emetiche e diarroiche provocate dai ceppi patogeni. 

SUMMARY                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                            Features of  Bacillus cereus groups  pathogen strains. In the text have been described. The features of  Bacillus  cereus  group pathogen bacteria. Their actual taxonomy and   their growths at  different temperature  have been also reported . In addition ,the mode of preventing their growth in  foods have been shown.

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