BATTERI PRODUTTORI DI INDIGOIDINA

La indigoidina (5,5’-diamino- 4,4’-ldiidrossi-3,3’diazadifenochinone-2,2’) è un pigmento blu insolubile in acqua prodotto da alcuni batteri che impartisce alle  loro colonie il colore blu. Nei batteri è sintetizzato da un complesso enzimatico (polipeptidico sintasi) per mezzo del quale  la glutamina si ossida, eterociclizza e si dimezza. (Elazari-Volcani 1939, Starr,1958; Khuun & Coll.1960, Ensign & Coll. 1963;Starr & Coll. 1966; Knackmass & Coll.1969).La sua pro-duzione fenotipica è  tuttavia instabile perché può essere influenzata dalla composizione del terreno di crescita  ( Starr & Coll. 1966;  Chatterje & Coll. 1981) e dal funzionamento di geni specifici responsabili della sua produzione ( Reverchon & Coll.1994,2001). Di seguito si riportano brevi descrizioni  dei germi elaboratori del pigmento blu  e  i terreni utilizzati dai vari ricercatori  per evidenziare i germi produttori del pigmento intracellulare.

CLAVIBACTER MICHIGANENSIS subsp.INSIDIOSUS

Microrganismo patogeno per i vegetali (specialmente il pomodoro) il   C. michiganensis è un germe Gram positivo, capsulato, immobile, non formante catene. Fa parte del genere l Clavibacter, nel quale sono presenti altre 6 specie e 7 sottospecie. Il genere è compreso nella famiglia Actinomicetales, phylum Actinobacteria. Forma caratteristici granuli blu nei terreni di coltura contenenti ed elevate quantità di zuccheri utilizzabili in 7- 14 giorni. Per l’isolamento del microrganismo si può impiegare il terreno di King B addizionato  con 200  mg/L di cicloesimide (EPPO 2010) (1)o il terreno   con formula: mannitolo  g  2,5;estratto di lievito  g 1,K₂HPO g 0,1,KH₂PO 0,05 agar g 18  H₂0 1L. addizionato di mg 250 di actidione (2) o il terreno di Ftayeh  & Coll.2011) (3) lievito :mannitolo  g 2,5,estratto di lievito  g  2,K₂HPO₄,  g 005  NaCl,g 0,1 , MgSO₄.7H₂O,MnSO₄ .7 H₂O, FeS0₄   7H₂O g ,0015 ,H₃BO₃ 0,6,agar g 15 pH 7,0-7,1

DICKEYA DADANII

E’ una Enterobacteriacea patogeno per le piante (sopratutto pomodoro)  Appartiene  al gMnClenere Dickeya, famiglia Enterobacteriaceae, ordine  Enterobacteriales, phylum Gamma Proteobacteria. Il genere comprende 8 specie. Il   germe era conosciuto con il nome di Erwinia chrysantemi. Il microrganismo è un fitopatogeno produttore di indigoidina in elevata quantità (Che& Coll.2010) la  cui produzione si evidenzia coltivandolo sul terreno YDC agar  così costituito: 1%  estratto di lievito, 2 % glucosio,2% carbonato di calcio ;agar 1,5 %,H₂O L 1(Dye 1968).Due altri terreni  utili per l’isolamento sono stati proposti da Zee & Coll. (2006) denominati  NG e NG+ MgCl_{2 .}4H₂ 0, con le seguenti formule : 1)NG:Nutrientagar+CaCl₂.2H₂0,MgCl₂.6 H₂ e  MnCl₂.4 H₂0 rispettivamente alla concentrazione   finale di  NG Medium: g 23 di Nutrient agar,10%  gli-cerolo , mg 0,4 ₂ Mn Cl₂ (2mM) ,H₂0 1 L. ,pH 6,5. Sterilizzazione a 121 °C per 10 minuti  Il periodo di incubazione è di 2-4 giorni

PHAEOBACTER COERULEUS

E’ un microrganismo Gram negativo con flagelli polari, ossidasi e catalasi negativo. Cresce  formando colonie blu  sul terreno Marine agar Difco 2219.Appartiene al genere Phaeobacter , famiglia  Rhobacteriaceae, ordine Rhobacteriales, classe  Alphaproteobacteria,phylum  Proteobacteria. Nel genere sono presenti altre 5 specie (Vandecandelaere & Coll,2014 ).La composizione del Marine agar  è la seguente : peptone g 0,5 ; estratto di lievito g 1,0; citrato ferrico g 0,1; NaCl  g 19,45; cloruro di magnesio g 8.8;solfato di sodio g  3,24; calcio cloruro g 1,8 ;cloruro di potassio g 0,55;bicarbonato di sodio g 0,16 ; bromuro di potassio  g 0,08; cloruro di stronzio g 0,034; acido borico g 0, 022; silicato di sodio g 0,004; fluoruro di sodio g 0,0024 ; nitrato d’ammonio  g 0, 0016; fosfato disodico 0,008;agar  g 15 ;  acqua distillata ml 1.000

PSEUDOMONAS  FLUORESCENS

Le Pseudomonas  fluorescens  sono batteri Gram negativi, ossidasi positvi facenti parte  del genere Pseudomonas, famiglia Pseudomonadaceae, ordine Pseudomonadales, classe Gamma Proteobacteria, divisione Gracilicutes, Regno Procariota. Nel genere sono presenti 213 specie. P seudomonas fluorescens è un germe aerobio obbligato presente in  diversi habitat come le piante, il suolo e le acque. Il nome deriva dal pigmento verde fluorescente denominato pioverdina. I ceppi della specie sono mobili per mezzo di molteplici flagelli polari. Elaborano  sideofori siderocromici per procurarsi il Ferro necessario per la loro crescita. Diversi ceppi sono usati in agricoltura per le loro proprietà anti-batteriche , antifungine e antitossine. Sono anche in grado di distruggere contaminanti chimici come idrocarburi policiclici aromatici, stirene, TNT e idrocarburi. Il genere Pseudomonas è composto da numerose specie di pseudomonas e in base alla  determinazione dei caratteri fenotipicii  di 305 ceppi di Pseudomonas Molin & Coll. (1986) hanno individuato  4 gruppi (clusters) di Pseudomonas fluorescens  precisamente : P.fuorescens biovar 1(I), biovar 2 (II), biovar 3(III), biovar 4(IV) ai quali è stato poi aggiunto il biovar V. Questa  suddivisione tassonomica resta ancora quella di identificazione più rispondente ai fini pratici rispetto a quelle  basate sul sequenziamento di  di frazioni del DNA pubblicate  da  Moore 1996),Anzi &  Coll. (2000).Yamamoto & coll. (2000) e da Mulet & coll.(2010). Le quali pur essendo di elevato  contenuto scientifico non hanno   sequenziato il DNA e  altri geni di  Pseudomonas lemonnieri, produttore di pigmento blu  classificato come biovariante IV da Molin & Coll,(1986). Poichè questo ceppo si è reso responsabile di chiazzature blu di alimenti di origine animali (formaggi tipo mozzarelle, prodotti  di salumeria e di carni fresche), si è ritenuto utile riportare la cronologia degli eventi oltre alla indicazione dei terreni  di coltura utilizzabili per il suo isolamento. La  prima segnalazione di mozzarelle chiazzate di blu   è stata segnalata  nei  2000  (Cantoni & Coll. 2000, )  ,e altra  sono state segnalate in anni successivi  (Cantoni & Coll.2003;2006).Oltre alle mozzarelle  , chiazzature blu si sono verificate anche a danno di tagli di carne fresca suina, di prosciutti freschi destinati alla cottura e di carcasse di conigli ( Cantoni & Coll.(2008). La formazione del  p biovar da parte di Molin & Coll (1986)  si basò sulla determinazione dei caratteri fenotipici di 16 ceppi ,dei quali 2 denominati P.lemonnnieri provenienti da due ceppi provenienti da due ceppoteche nazionali e dall’analisi di 14 ceppi produttori di pigmento blu. Identificato da da Kun & Coll,Starr&Coll. (1966) e Starr (1967), P.lemonnieri è stato isolato e descritto  nel 1913 da Lasseur .In un primo tempo la sua posizione tasson omica fu discussa da Hugo & Coll. (1957) e da Starr &Coll.(1960) poi Steiner & Coll. posizionaro il microrganismo  come biotipo F di Pseudomonas fluorescens, a sua volta poi identificato nel biovar IV da Molin & Coll. (1986).Oltre va Hugo &  Coll. (1956)né stato isolato dal suolo da  Veron & Coll.(1968),da  Skvortsova & Coll. (1979),da Matei & Coll. (2006). Il pigmento blu  fu identificato come indigoidina da Starr & coll.(1967 ). Dagli alimenti con chiazzature blu,è stato costantemente isolato un altra specie di Pseudomonas identificato come P.libanensis (Daboussi & Coll.(1999),una nuova specie isolata dalle acque  nel Li produttrice di un pigmento fenazinico verde scuro solubile  in acqua,i dentificato come PCA o fenazina-1-acido carbossilico (Saini & Coll.2008). A partire dal 2010 nel nostro paese si  sono verificati numerosi casi di colorazioni blu in mozzarella  dai campioni esaminati si sono isolati  pulso tipi responsabili della colorazione  blu impartita  dal pigmento insolubile blu ( Martin & Coll. 2011,Nogarol & Coll.2013;Andreani & Coll.2014).Infine Caputo & Coll. (2015)hanno identificato il pigmento prodotto dai  ceppi come  indigoidina riconfermando la identificazione precedentemente riportata dai ricercatori citati precedentemente. Per il controllo sistematico delle produzioni necessario per escludere la presenza nelle acque e nei liquidi di governo  si deve disporre di terreni colturali solidi atti ad evidenziare la eventuale del microrganismo in grado di garantire la produzione dl pigmento blu .In proposito sono stati proposti i seguenti terreni: 1) YDC agar contenente : estratto di lievito Difco 1%,glucosio 2%, , carbonato di calcio purificato 2%, agar Difco1,5 %.Acqua 100 ml.(Starr & Coll.(1967),2) terreno di Xinhiu & Coll.: triptonem8-12 g, estratto di lievito 4-6 g., acqua ml 1.000,agar 18   g..3)R2A Reasoner & Coll.(1985):  0,5 estratto di lievito, g 0,5 Difco  proteose peptone no 3 Difco,g 0,5 Casamino Acids (Difco), g 0,5 glucosio, g 0,5 amido solubile ,g  0,3 K₂ HPO₄,g 0.05 Mg SO₄.7H₂O, g 0,3 sodio piruvato, g 15 , H₂O distillata, ph 7. 4) Potato destrose agar :g 4 di estratto di patata, g 20 destrosio, g 15 agar, acqua 1000 ml. 5) Mascarpone  agar:   g 500  mascarpone, g 5 estratto di lievito, g 20   destrosio, g 18 agar, acqua distillata l 1.000 (Cantoni & Coll.2000)

SHEWANELLA VIOLACEA

E’ un batterio Gram  negativo, ossidasi  positivo, aerobio. anaerobio facoltativo eterotrofo, mobile con un flagello polare. Appartiene al genere  Shewanella, famiglia Shewanellaceae, ordine Alteromonadales, classe  Gamma Proteobacteria. Il ceppo produce  pigmento indigoidina sul   terreno Marine broth 2216 Difco così modificato ;Terreno MB + g 0,5 %  estratto di lievito, 0,2 % Casaminoacid Acid + agar g 1,5 %.(Kobayashi & Cll.(2007).

SINOMONAS  ATROCYANEA (già Arthrobacter atrocyanea)

Le cellule microbiche sono Gram variabili e la loro morfologia muta da cocco a bastoncino. Sono aerobie e mesofile. Producono indigoidi-na crescendo sul terreno YDC  incubato a 30° C con formula : g  20 di carbonato di calcio sminuzzato finemente, g 20 glucosio, agar  g 15 o 18.H₂O  1L . Appartiene  al genere Sinomonas con altre  50 specie.Il genere fa parte della famiglia  Micrococcaceae, ordine Actinomycetales, sottoclasse  Actinobacteridae, classe Actinobacteria, phylum Actinobacteria. (Zhou & Coll.2009).

VOGESELLA INDIGOFERA

Il  batterio è un aerobio Gram negativo produttore di indigoidina .Appartiene al genere  Vogesella con altre 5 specie ( Grimes  & Coll.1997)Il genere fa parte della famiglia delle Neisseriaceae,ordine Neisseriales,classe Beta  Proteobacteria, phylum  Proteobacteria. Il germe è mobile  con flagello polare e con forma di bastoncino. Si presenta solo, appaiato in corta catena, occasionalmente con forma vibroide .Le colonie si sviluppano su terreno PCA dapprima con colorazione gialla che vira al blu dopo 24 -48 he il pigmento è appunto indgoidina ( C₁₀ H₈ N₄O₄ o 5,5^ì-diamino-4,4^’ – diidrossi -3,3^’-diazadifenochinone-2,2^’.

Conclusioni

Come  è stato segnalato in precedenza la difficoltà dell’isolamento dei batteri produttori di indigoidina è rappresentato dalla mancanza di un terreno di uso comune sul quale i batteri possano sintetizzare il pigmento e rendersi cosi  rapidamente identificabili. Nel  settore lattiero caseario si usa il mascarpone agar  che  consente  lo sviluppo di colonie di Pseudonas specie produttrici sia di indigoidina che di fenazine. Sarebbe  interessante valutare anche il comportamento del terreno Marine agar come tale o addizionato di glutammina che dovrebbe favorire la formazione del pigmento blu dei ceppi biovar IV- La messa a punto di un terreno rispondente a questo scopo è di fondamentale importanza per conoscere la presenza del microrganismo nelle acque e nei liquidi di governo per la prevenzione della  contaminazione.

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