BIOFILMS NELL’INDUSTRIA DELLA CARNE

Carlo Cantoni. Libero docente  di  Ispezione degli alimenti di origine animale. Milano Stefano Ibba. Medico Veterinario, Milano

I biofilms come si presentano in natura consistono principalmente di microrganismi vitali e non vitali  inglobati in sostanze  polianioniche  polimeriche extracellulari adese ad una superficie solida (Chmelewski & coll. 2003). Le sostanze polimeriche extracellulari  sono formate da polisaccaridi, proteine, fosolipidi, acidi tecoici, e nucleici e altre sostanze polimeriche e con  80-85% di umidità. Le EPS svolgono un’azione protettiva ai microrganismi presenti nel biofilm fornendo nutrienti e impedendo l’accesso di biocidi, metalli, tossine e impedendo l’essiccamento. I biolfilms dell’industria alimentare possono contenere  residui e minerali  derivanti dal tipo di  alimento lavorato  e dall’acqua utilizzata. I biofilms possono avere un elevato livello  di  organizzazione poiché possono essere  presenti in comunità formate da singole o più specie batteriche fornendo loro uno strato singolo o una struttura tridimensionale oppure possono formare  aggregati a forma  di fiocco o di granulo

Formazione del biofilm.

 I batteri  presenti nelle superfici di lavorazione delle industrie  della carne possono svilupparsi formando biofilms. Questi ambienti presentano una varietà di condizioni tali da favorire la  loro formazione per la esistenza di nutrienti, umidità e presenza di microrganismi sulla superfici delle carni. Cosi il biofilm, dopo la sua formazione, costituisce una fonte una potenziale fonte di  contaminazione degli alimenti che può esitare  nella loro alterazione o nella trasmissione di germi patogeni. Inoltre, quando un biofilm si distacca dalla superficie abiotica, i singoli microrganismi possono diffondersi.

I batteri formanti biofilms sono stati Salmonella spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Campylobacte spp., Escherichia coli, E.coli STEC, Listeria spp., Staph.aureus.

Formazione di biofilm.

La colonizzazione batterica di una superficie solida  è un processo polibasico che coinvolge fattori fisico chimici e biologici. La formazione del biofilm avviene in 5 fasi: 1) una iniziale adesione del microrganismo platonico alla superfice solida.

2) La transazione da reversibile alla adesione irreversibile del microrganismo in seguito alla sua produzione di polimeri extracellulari da parte del microrganismo.

3) primo preliminare sviluppo della struttura del biofilm.

4) sviluppo di microcolonie  nel biofilm maturo.

5) dispersione dei microrganismi dal biofilm nell’ambiente circostante.

In dettaglio, il processo avviene così:

Il primo evento è  costituito dall’assorbimento di molecole organiche ed inorganiche sulla superficie solida. Ciò determina la formazione di un substrato condizionanti la presenza del microrganismo, o primer batterico, che favorisce la capacità del batterio ad aderire a questo substrato. In particolare le proteine spesso formano substrati che favoriscono l’adesione batterica. Nella produzione di alimenti si riscontra con maggiore frequenza la formazione di biofilms in presenza di una elevata concentrazione di proteine. Ad esempio le proteine del siero di latte sono prevalenti negli impianti di lavorazione del latte ed è stato dimostrato che aumentano l’adesione batterica aumentando anche l’adesione dei batteri lattici. 

Dopo  che si è formato il primo strato condizionante la adesione batterica procede. I fattori e i procedimenti di lavorazioni favorenti l’aumento dell’adesione batterica sono  i valori estremi alti o bassi di pH e le elevate temperature di contatto delle superfici di lavorazione, che entrambi denaturano le proteine facilitando la formazione degli strati condizionatori. Inoltre lenti flussi di liquidi sopra il biofilm aumenta il tempo di contatto con i nutrienti presenti nello stesso. Altri fattori sono la disponibilità di nutrienti, che è ubiquitaria negli impianti di  produzione di alimenti, la durata del tempo di contatto del batterio con la superficie, a fase di  crescita del  germe e la idrofobicità del substrato. Interessante è sapere che la vitalità della cellula batterica ha una importanza limitata sulla propensione all’adesività. Le cellule batteriche vive o morte aderiscono alle superfici con la stessa  propensione. L’adesione batterica è mediata dalle fimbrie, pili, curli, fagelli, tutte appendici che si estendono all’esterno della cellula. L’adesione batterica è anche rafforzata dai polisaccaridi extracellulari che formano un ponte tra i batteri e lo strato  condizionatorio. Il ponte è una combinazione di  legami idrogeno, ionici, covalenti, di forze elettrostatiche, forze di Van der Walls e interazioni idrofobico, interazioni dipolo-dipolo. Inizialmente, i legami tra i batteri e lo strato condizionatore ma non sono tenaci e possono essere rimossi dal  lavaggio. Tuttavia, col tempo, questi legami sono rafforzati rendendo l’adesione a contatto irreversibile.

Una volta inglobati entro il biofilm e cellule lesionate o insufficientemente  sviluppate per mancanza di nutrienti hanno la opportunità di ripararsi, di metabolizzare i nutrienti  presenti nello spazio condizionato, di crescere e di riprodursi. Continuando a  moltiplicarsi i copiosi volumi di polisaccaridi extracellulari prodotti assicura una barriera protettiva intorno alle cellule. Le materia inorganica ed organica che giunge  a contatto col biofilm vengono assorbite aumentando le dimensioni del biofilm e rifornendo  ulteriore nutrimento. I biofilms si sviluppano  rapidamente quando vi è una fonte continua di nutrimento. In tali condizioni, un biofilm può considerarsi “maturo” entro 24  ore e può continuare ad aumentare in dimensioni millimetriche in pochi giorni. Lo sviluppo di un biofilm può avvenire entro 1 ora  con  il 10% di  popolazione batterica  aderente irreversibilmente allo strato condizionatorio. Dopo 8 ore di produzione più del 91% di batteri sono adesi irreversibilmente. 

Come il biofilm matura, aumenta la resistenza contro vari disinfettanti probabilmente per la produzione di polisaccaridi extracellulari. La rimozione del biofilm durante le operazioni di sanificazione routinarie diventa un compito difficile da realizzare perché l’aumento del tempo di contatto col sanitizzante e quello dell’attività meccanica necessaria richiedono maggior costo del personale e un tempo più lungo per la rimozione.

Presenza di biofilms  nelle strutture di lavorazione e produzione degli alimenti.

Biofilms sono rinvenibili non solo sulle superfici di lavorazione ma anche sulle superfici di prodotti, specialmente vegetali. Le superfici delle strutture sono costituite da acciaio inossidabile, alluminio, vetro, guarnizioni di Teflon e possono supportare biofilms. Le superfici degli ambienti di lavorazione possono essere contaminate per via aerea, dal personale e dalle operazioni di pulizia. Biofilms sono stati riscontrati su superfici a contatto con alimenti come guarnizioni, nastri trasportatori, pastorizzatori e in attrezzature con fessure e spazi morti. Queste zone spesso sono difficili da raggiungere durante la pulizia e la sanificazione creandosi così  delle condizioni ideali per lo sviluppo di biofilms. Anche le superfici corrose, rotte, fessurate trattengono particelle  di  cibo e costituiscono siti ideali  per permettere la formazione di biofilm. (Sofos 2009).

Biofilm nell’industria della carne.

Durante le fasi di abbattimento dell’animale, le carcasse possono essere contaminate da batteri provenienti da diverse fonti quali le feci, la pelle, il tratto gastrointestinale, i linfonodi, l’aria, l’essere umano. Lo scuoiamento e l’eviscerazione potenzialmente causano  la dispersione di microrganismi conseguentemente le superfici di lavorazione della carne e le attrezzature presenti nell’ambiente  possono venire contaminate dalla carcassa, dagli ingredienti, dall’acqua da roditori e da insetti. Sulla superficie della carne si sviluppano batteri durante la refrigerazione con variazioni della popolazione batterica  tra quella della carne e  quella delle attrezzature. 

I batteri presenti possono essere non patogeni e patogeni. 

I principali generi isolati da carni bovine sono: Pseudomonas, Staphylococcus, Enterobacter, Flavobacterium, Klu-viera, Moraxella, MicroGram negativicoccus, Bacilus, Kocuria, Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Brochotrix, Gemella, Proteus, Corynebacterium , Erysipelotrix, Kurthia, Enterococcus. In generale i batteri Gram negativi formano più biofilms rispetto ai Gram positivi compresa L.monocytogenes. La formazione più elevata di biofilms è stata osservata  per Acinetobacter, Citrobacter e Pseudomonas. Gli Enterobacter formano poco biofilm paragonato a quelli degli altri enterobatteri.

Batteri non patogeni. 

Pseudomonas è il genere più presente e le Pseudomonadaceae sono  pure i principali alteranti le carni. La contaminazione di queste durante la lavorazione proviene dall’acqua, le mani, e i materiali. Vi sono prove che le Pseudomonas spp presenti sulle superfici dei tavoli di lavorazione possono colonizzare le superfici inferiori delle canaline e dei tubi di acqua delle stanze di lavorazione. I microrganismi sono trasportati per via aerea da aerosols prodotti durante la pulizia dei tombini e degli ugelli  dei depuratori. Il biofilm delle Pseudomonas spp è composto da t polisaccaridi (levano, alginato Pel, cellulosio), DNA, proteine, materiale proteico non definito, Rhamnolipidi, pili  di tipo IV (TAP) e flagelli.

Batteri patogeni. 

Salmonella. Diverse ricerche hanno dimostrato la capacità  di ceppi di Salmonella di formare biofilms su varie superfici abiotiche come  plastica, (politilene polistirene), gomma, cemento, acciaio inossidabile che possono trovarsi comunemente nelle fattorie, macelli, abitazioni, industrie di lavorazione delle carni, cucine, toilette e bagni. Salmonelle possono formare biofilms anche su vegetali (alfa alfa, lattughe). Inoltre le salmonelle sono capaci di aderire e di formare comunità batteriche, microcolonie e anche biofilms maturi sulle cellule vegetali e animali. I biofilms sono composti da  esolipolisaccaridi, polisaccaridi (cellulosa, acidi colanici, antigene capsulare o anionico) e da materiale proteico costituito da fimbrie tipo 1 (Pef), fimbrie curli (Csg), fimbrie polari (Lpf fimbrie aggregative (Tafi o agf), da fattori di  colonizzazione (Bcf ee Sth) e da flagelli. 

Escherichia coli produttori di tossina Shiga. La specie Escherichia coli comprende  ceppi membri della normale  popolazione commensale degli esseri umani ed animali e ceppi patogeni per  gli stessi soggetti citati. 

I ceppi patogeni fanno  parte di due gruppi:  gli E.coli intestinali (InPEC) e gli E.coli extraintestinali (ExPEC). Questo  secondo gruppo è responsabile di infezioni del tratto urinario (UPEC), di sepsi neonatali e di anziani, di meningiti, e di varie  malattie infettive animali incluse le mastiti. Gli inPEC sono classicamente divisi in 8 sottogruppi  in base alle malattie provocate,i loro fattori di virulenza e la loro filogenesi. 

Gli 8 patotipi sono: gli E.coli aderenti-invasivi (AIEC) associati con la malattia di Crohn, gli E.coli  diffusamente aderenti (DAEC), gli E.coli enteroaggregativi (EAEC), gli E,coli enterossigeni (ETEC), gli E.coli enteropatogeni (EPEC), gli E.coli produttori di tossina  Shiga (STEC) che comprendono i ceppi enteroemorragici E.coli (EHEC) e gli E.coli enteroinvasivi (EIEC) che comprendono anche la Shigella. 

I ceppi STEC sono diffusi in tutto il mondo nelle acque e sono patogeni alimentari. 

I bovini sono un importante  serbatoio di STEC e in questa specie colonizzano asintomaticamente; possono essere presenti in nelle feci di pecore, capre, tacchini e suini. Gli episodi delle malattie da STEC sono tipicamente associate a carni bovine contaminate: tuttavia il latte non pastorizzato, l’acqua contaminata, le verdure fresche e certi frutti contaminati e succhi di sidro si sono rese responsabili di malattia. Gli STEC  possono persistere per parecchio tempo nell’ambiente esterno, nelle acque e nel terreno. I ceppi EHEC sopravvivono per più di 8 mesi nell’acqua contaminata da feci bovine. Gli STEC sono anche una delle principali preoccupazioni negli impianti durante la lavorazione delle carni e la contaminazione delle carcasse con STEC può  verificarsi nelle fasi di macellazione, scuoiamento e taglio. Pertanto popolazioni di STEC sono rinvenibili sulle superfici della varie attrezzature impiegate e possono diventare fonti di ulteriori contaminazione dei tagli carnei. La presenza di STEC nei bovini e negli impianti di lavorazione è ben documentata ed è stato ipotizzato che la loro capacità di formare  biofilms su differenti superfici sia responsabile della distribuzione e della persistenza di STEC negli stabilimenti di produzione della carne.

Diversità genetica dei ceppi STEC.   

Il sierotipo  STEC predominante  più noto associato con episodi di malattia è  lo O157:H7. Questo è uno dei primi sierotipi identificato quale causa della sindrome uremica (HUS). Tuttavia altri sierotipi clinicamente importanti sono stati identificati: O26, O45, O103, O111 e O145. Altri   sierotipi  (O113:H21 e O91:H21) in genere causano sporadici casi di  HUS. Un altro sierotipo  responsabile di numero avvenuti  casi in Germania nel 2011 è il sierotipo O104:H4. Il microrganismo è un tipico EAEC  con presenza del gene, trasportato per via orizzontale da un batteriofago, stex2  responsabile della  produzione della tossina (STEAEC).   

Nella formazione dei biofilms intervengono  vari fattori;

1) Nella prima fase di contatto con le superfici (Primo contatto) : la  mobilità dei flagelli; la superficie di adesione, (rogosità, idrofobicità), il tipo di substrato,la temperatura,il pH,le forze ioniche;

2). Nella fase di attacco: le adesine fimbriali: tipo 1; curli, pili tipo 4. Fibre lunghe polari, fimbrie F9, capsula, LPS, proteine;

3)Nella fase di maturazione: gli autotrasportatori (adesine),EPS, PGA, cellulosa acido colanico, capsula, LPS, QS e proteine.

4) La fase finale è la dispersione del biofilm ma le cause per ora sono sconosciute.La matrice del biofilm di E.coli  ,quindi,formata da 3 differenti EPS: la poli-N-acetilglucosamina, (PGA), l’acido colanico e/o  cellulosa e LPS..Negli ambienti di lavorazione delle carni gli STEC aderiscono  alle superfici di acciaio inox,di polistirene,di vetro, di poliuretano, di polietilene ad alta densità. (Vogeler & coll.(20014).

Caratteristiche del biofilm.   

E.coli O157:H7 rimane per 4 giorni sulle superfici  di acciaio inox insieme agli acidi organici rimasti nei fluidi di lavaggio delle carcasse. Rimane adeso alle superfici di acciaio inox e di politilene ad alta densità non solo alla temperatura di 15,5 °C ma anche a  9,4 °C dimostrando così la necessità di  adottare modalità diverse per i vari siti da sanificare. Il grasso bovino  trasmette meglio l’E.coli O157:H7 alle superfici di contatto della lavorazione della carne rispetto al tessuto muscolare. I residui essiccati della lavorazione della carne facilitano l’adesione e lì inglobamento del germe. Se introdotto nei locali di lavorazione E coli O157:H7 deve essere considerato una fonte di contaminazione poiché il patogeno può aderire e crescere anche con poca  disponibilità di nutrienti, se la temperatura lo permette. 

Le superfici di materiale plastico di contatto favoriscono la formazione di biofilm meglio di quelle in acciaio inox. Quando adeso alle superfici secche  il patogeno aderisce più tenacemente rendendo più difficile la rimessione e con ciò dimostra  la necessità di appropriati trattamenti sanitizzanti  da adottare per la sanificazione delle superfici dopo la lavorazione.  I residui carnei facilitano l’adesione mentre i batteri alteranti possono permettere la crescita di E.coli O157:H7 nei loro biofilms. Quando i biofilms sono presenti, i sanitizzanti dovrebbero essere applicati alle massime concentrazioni ammissibili e lasciati a contatto delle superfici per lungo tempo. (Sofos  2009).

Listeria monocytogenes. L.monocytogenes è un germe ubiquitario nell’ambiente resistente a diverse condizioni  ambientali avverse. E’ presente nel modo vegetale (piante vive o morte), nell’acqua e nel suolo. E’ un contaminante di molti alimenti. In genere si ritiene che i biofilms presenti negli impianti di lavorazione degli alimenti siano   fonti importanti della contaminazione degli alimenti. 

Esistono 13 sierotipi distinguibili: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e,7. L.monocytogenes differentemente dai batteri Gram negativi descritti  è uno scarso formatore di biofilm. I ceppi isolati produttori di biofilms appartengono ai serovars 1/2a, 1/2b (divisione filogenetica II) mentre i ceppi del serovar 4b (Divisione filogenetica I) sono scarsi produttori. Esistono differenze  nella capacità di aderenza e di formazione tra i ceppi persistenti e quelli non persistenti di L.monocytogenes e tra i ceppi  delle 4 divisioni filogenetiche. Sono conosciute  differenze nella produzione di biofilms tra ceppi aderenti e non aderenti e tale divisione genetiche. Secondo alcuni ricercatori L.monocytogenes preferirebbe far parte di biofilms prodotti da altri batteri che elaborare un suo specifico. La struttura del biofilm  di L.monocytogenes è tridimensionale formando una struttura a nido d’ape o gruppi di aggregati circondati da spazi vuoti. Inoltre lo spessore del biofilm  può variare  a livello cellulare più ridotto al centro  e più denso in superficie. La crescita di L.monocytogenes è assai più lenta rispetto a quella delle listerie plantoniche. (Rodriguez-Lozano& coll.2009;Moretro &coll.2013). Sintetizzando: *Le cellule di L.monocytogenes hanno la capacità di  aderire a  varie superfici a contatto con alimenti quali polietilene, polipropilene e laminati. Se questi non sono adeguatamente puliti esse producono biofilms resistenti ai sanificanti. Molti tipi di biofilms contengono livelli elevati di L.monocytogenes che sopravvivono fino a 14 giorni su superfici di polietilene ad alta densità  e polipropilene tenute a temperatura ambiente. L..monocyto-genes sopravvive ed è stata isolata da superfici di laminati tenuti a temperatura ambiente (25°C:50% e 90% di umidità) in presenza di residui di cibo (prosciutto cotto) dopo 96 giorni. I biofilms sopravvivono meglio su superfici rugose che sulle superficie lisce di polietilene ad alta densità. I sanificanti sono più efficaci sui biofilms vecchi sviluppatesi su superfici lisce rispetto  a quelli cresciuti su superfici  ruvide, le nicchie umide sono le zone di principale sviluppo dei biofilms di L.monocytogenes. Sebbene i sanificanti siano efficaci sulle cellule adese platoniche, la loro efficacia diminuisce con l’aumentare del volume del biofilms. I sanificanti acido acetico, ac. Lattico, sodio ipoclorito, ammonio quaternario e  combinazioni con perossido d’idrogeno sono efficaci per la riduzione delle cellule  di L.monocytogenes, specialmente di quelle giovani. 

I biofilms prodotti da ceppi della Linea I hanno maggiori dimensioni di quelli prodotti da listerie delle linee II e III  quando sviluppatesi su  superfici di acciaio inox. Sulle stesse superfici formano biofilms entro 3 ore dalla adesione e  la maturazione  del biofilm si completa in 240 ore, ma porzioni dello stesso si verificano già dopo 96 ore. Un sanificante a base di acido lattico (pH 3,03) è molto efficace, mentre  i sanificanti  a base di ammonio quaternario  con pH elevato (10,5-11,5) riescono più efficaci di quelli a pH inferiore (6,2-8.7). L’attività dei sanificanti aumenta a temperature calde (25°C) e con un con  un tempo di esposizione di almeno 10 minuti. (Djordievic & coll. 2002; Sofos 2009; Mattos de Oliveira & coll.2010).

Campylobacter. Campylobacter è un genere di batteri appartenenti alla famiglia delle Campylobacteriaceae. Nel genere sono presenti 32 specie ve 13 subspecie. Nei vari ambienti naturali  possono formare aggregati non aderenti con forma di fiocco. di interfacci nei liquidi e biofilms. In proposito il la specie più studiata è il C.Jejuni che  è la specie predominante tra i Campylobacter presenti nelle carni di pollo. Campylobacter spp sono stati ritrovati in biofilms presenti in  apparecchi per  l’inaffiamento e in sistemi idraulici di allevamenti avicoli e di impianti di lavorazioni delle carni di pollo. Questi biofilms sono un rifugio per microrganismi patogeni e non patogeni perché li proteggono dagli stress ambientali e dagli agenti antimicrobici presenti nei sanificanti. Così i biofilms possono diventare fonti di contaminazione di C.jejuni nell’industrie avicole. I Campylobacter producono biofilms in scarsa quantità minore di quella formata dagli altri microrganismi. Si trovano  invece presenti in biofilms formati da Enterococcus faecalis ve Staphylococcus simulans normalmente presenti negli ambienti avicoli e nelle carni di pollo. La formazione di biofilms avviene in anaerobiosi sebbene in aerobiosi possa verificarsi ugualmente.(Jousua & coll.2006, Teh & coll.2010).

Enterococcus spp. Gli Enterococci sono germi Gram positivi cocchi che sono ubiquitari ma presenti nel tratto intestinale dell’essere umano ed animale. Il biofilm   prodotto è formato da proteine, acido teicoio e esopolissacaridi come nei biofilms di  Staphylococcus.

Riassunto.

Nella relazione sono descritti i germi produttori di biofilms nell’industria della carne e la loro localizzazione.

Summary Biofilms in meat industry

The report describes the bacteria which produce  biofilms  and their location in meat industry

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