venerdì 1 agosto 2014

Ruolo di LAB e di altri microrganismi nel rigonfiamento di confezioni di alimenti refrigerati



Carlo Cantoni, libero docente in ispezione degli alimenti di origine animale, Milano
Stefano Ibba, medico veterinario, Milano

Attualmente numerosi alimenti sono commercializzati refrigerati e confezionati in involucri di materia plastica sottovuoto o in atmosfera modificata protettiva (MAP) per periodi di commestibilità indicati in etichetta. Nei banchi di vendita i consumatori trovano alimenti vari come luncheon meat, prodotti di salumeria, carni. Insalate vegetali, paste fresche, salse, prodotti lattieri caseari, cibi cotti, pollame e porzioni relative, minestre, piatti pronti per il consumo. Il fattore più importante che determina la loro commestibilità e costituito dalla loro refrigerazione.
La faccenda principale microbiologica di questi alimenti verte su due gruppi di microrganismi  psicotrofi: patogeni psicrotrofi e alteranti psicrotrofi. Germi patogeni psicrotrofi e mesofili potrebbero  crescere negli alimenti in caso di superamento della temperatura di refrigerazione  oltre ai limiti stabiliti.
Gli psicrotrofi sono batteri, lieviti e muffe che crescono lentamente alla temperatura di refrigerazione (< 7°), ma che crescono ottimamente a temperature superiori (25-30°). La temperatura massima di crescita per alcuni di loro può raggiungere i 37° C (p.e. Listeria monocytogenes ). I patogeni mesofili sono ancora vitali alle temperature di refrigerazione e crescono quando la si supera. Si sviluppano bene tra 20 e 45°C, con una crescita ottimale tra 30 e 40°C.
Gli psicrotrofi non patogeni alteranti hanno temperature minime di crescita tra 1 e 7°C rivestendo un ruolo fondamentale per la vita commerciale degli alimenti refrigerati confezioni e sono l’oggetto di questa trattazione. Alcuni di questi microrganismi fanno parte del gruppo Acinetobacter-Moraxella, altri sono Alcaligenes  spp., Flavobacterium spp., Microbacterium spp., Xantomonas spp, ma i principali psicrotrofi alteranti conosciuti sono Brochotrix thermosphacta, Pseudomonas spp batteri lattici spp (LAB) e Leuconostoc spp.Questi due ultimi gruppi di microrganismi saranno trattati in dettaglio perche responsabili del rigonfiamento di confezioni di alimenti refrigerati.
Batteri lattici omofermentanti ed etero fermentanti.
I batteri lattici (LAB) sono presenti comunemente nei prodotti lattiero caseari e nei prodotti carnei fermentati. La loro caratteristica fondamentale è la formazione di acido  lattico come principale sottoprodotto durante la fermentazione degli zuccheri. I LAB possono presentare forma bastoncellare o sferica ( coccica) e, in genere, tollerano substrati acidi ( con pH acido) più di altri batteri. I LAB in natura sono presenti nei vegetali e fanno anche parte della popolazione residente della cavità orale e dell’intestino dell’essere umano e di altri mammiferi. Diverse specie di LAB sono utilizzati come colture di avviamento ( ceppi starter) o per la bioprotezione di carni e di salumi. Altre specie di LAB possono moltiplicarsi negli stessi prodotti acidificandoli o determinando il rigonfiamento delle loro confezioni.
I LAB sono distinti in omofermentanti ed in eterofermentanti in base ai metaboliti formati durante la fermentazione degli zuccheri (p.es. glucosio). I LAB omofermentanti fermentano il glucosio producendo acido lattico principale quale sottoprodotto derivato.  I LAB omofermentanti comprendono le Lactococcus spp. Impiegate come starter in certi tipi di formaggi perché causano la rapida acidificazione della pasta del formaggio. Altre specie di omofermentanti sono Lactobacillus spp (a forma bacillare) e Streptococcus spp (cocchi formanti catena).Altri cocchi di isolabili da latte e prodotti lattiero caseari sono Enterococcus spp, Pediococcus spp e Aerococcus spp, a non svolgono alcun ruolo nel rigonfiamento delle confezioni.
I LAB eterofermentanti fermentano il lattosio formando acido lattico, etanolo, acido acetico e CO2. Eccettuato il loro impiego in certi prodotti lattiero caseari e in vegetali fermentati, non sono impiegati come ceppi starter, sebbene possano essere presenti negli alimenti con il ruolo di contaminanti. Quando crescono in numero significativo (106 upfc/g e più) formano gas ed odori sgradevoli (Johnson 2001).Il galattosio residuo nella pasta del formaggio è un esempio di substrato che può venire metabolizzato da molti batteri etero fermentanti con produzione di CO2.. Al gruppo degli etero fermentanti fanno parte  L.brevis, L.buchneri, L.fructivorans, L.fermentum, L.reuteri, L.oligofermentans, L.oryzae. Tutti ceppi isolati da prodotti lattiero caseari sopratutto.
Altre  lattobacilli sono denominate etero fermentanti facoltativi  perché producono CO2  e altri metaboliti solo in certe condizioni o in presenza di substrati  specifici.  I lattobacilli   in grado di provocare rigonfiamento delle confezioni di alimenti refrigerati sono: L.bifermentans, L.casei subsp.paracasei, L.casei subsp.tolerans, L.curvatus, L.plantarum, L.paraplantarum, L.sake var.sake. Altri  LAB  hanno  la  capacità  di produrre gas da altri substrati  come il citrato, il gluconato e certi aminoacidi, ad esempio il L.lactis subsp lactis var.diacetilactis. Nei formaggi  lo sviluppo degli etero fermentanti si   verifica quando i ceppi omofermentanti  non metabolizzano completamente gli zuccheri gli zuccheri  ancora predenti e questi quindi completano la loro  fermentazione (Ledenbach & coll.2009).

Leuconostoc
I Leuconostoc sono batteri Gram positivi con forma ovoide, formanti  catene, etero fermentanti e  producenti mucosità nei prodotti alimentari. Fanno parte del genere Leuconostoc, famiglia Leuconostocaceae, ordine Lactobacilles. I Leuconostoc  si trovano nei materiali vegetali in decomposizione e si sviluppano bene in alimenti vegetali fermentati, come cetrioli, kimchi e olive (Maki 2004; Kim coll.2005)-.Leuconostoc sono pure presenti in basse concentrazioni nei  vegetali verdi e  nelle radici ( Mundt  & coll., 1967; Hemme&coll.2004). Conseguentemente, per la loro presenza nei vegetali, i leuconostoc si  trovano frequentemente negli  alimenti di origine animale  come latte, latticini vari, carni, pollame e pesci (Bjorkroth & coll.2006). Nel genere sono comprese 23 specie ma quelle responsabili di rigonfiamento sono state: L.carnosum  (prosciutto affettato), L.gascomitatum (conserve ittiche), L. L.gelidum (wurstel) L.mesenteroides (prosciutto affettato, wurstel, sandwich vari) (Sade 2011 ).

Miceti
Il basso pH e  le proprietà  nutrizionali dei formaggi  favoriscono l’alterazione da lieviti. L’umidità superficiale, la presenza di peptidi, di aminoacidi consentono la loro moltiplicazione soprattutto in caso di sbalzi termici. Molti ceppi di lieviti producono alcol e CO2 emanando odore caratteristico di lievito nelle confezioni (Horwood & coll.1987). Di conseguenza le confezioni di formaggi confezionati sottovuoto o in MAP possono gonfiarsi per la produzione di  CO2 formata dal metabolismo dei lieviti (Vivier & coll.1994).I lieviti responsabili sono specie appartenenti ai generi Saccharomyces, Zygosaccharomyces  e Deuteromyces.
Dati  sperimentali osservati e cause del rigonfiamento  delle confezioni
Sandwich, tramezzini, panini farciti con carne, formaggi salsa yogurt o con vegetali, confezionati in involucri di materia plastica sottovuoto o con MAP sono gli alimenti le cui confezioni  sono spesso soggette a rigonfiamento (bombaggio). LAB etero fermentanti, soli o con lieviti, produttori di CO2 sono gli agenti responsabili dell’evento. Negli alimenti presenti nelle confezioni  si isolano, di solito, da 15 x 106  a 90 x 106 ufc/g di LAB etero fermentanti e da 2,5 x 105  a 5,7 x 105 lieviti, quando presenti. Normalmente per  queste preparazioni alimentari è prevista una vita commerciale di 30 giorni a +4°C. Le fonti primarie di   contaminazione  sono identificabili nelle materie prime (formaggi  e vegetali) oppure  sono   contaminazioni ambientali durante la preparazione Formaggi e condimenti a base di latte le  sono le fonti  dei LAB  mentre vegetali  ed ambiente sono  quelle dalle quali provengono i lieviti.

Misure di controllo materie
Per limitare od evitare i bombaggi è necessario impiegare materie prime di elevata   con basso o nullo contenuto in psicrotrofi e nel caso specifico impiegando formaggi stagionati o fusi o a pasta filata compatta. Per  la frequente  aggiunta di salsa yogurt alle carni è doveroso controllare  la presenza di etero fermentante tenendo presente che per la sua preparazione  si ricorre all’impiego di aglio o cipolla e spezie varie. I vegetali crudi dovrebbero essere sanificati  prima dell’aggiunta.  La   manipolazione delle materie prime deve essere   effettuata rigorose norme igieniche. L’attrezzatura  impiegata  nella  preparazione degli alimenti da confezionare   deve essere (1) inerte  per l’alimento; 2)liscia e non porosa;3) facilmente  accessibile per il controllo e l’ispezione visiva;4) pulibile e disinfettabile; 5) deve  essere situata in ambiente esente da contaminazioni aeree e ambientali; 6)deve essere pulita  e sanitizzata prima della lavorazione e, nel caso, durante la stessa  per evitare lo sviluppo di  biofilm, fonti  ulteriori di contaminazione. L’effetto delle operazioni di pulizia e di sanificazione deve  venire controllato con analisi batteriologiche eseguiti su prelievi eseguiti con spugnetta o mediante l’impiego di piastre a contatto con terreno nutritivo o mediante  la  bioluminescenza. La filtrazione dell’aria entrante nell’ambiente  di  lavorazione  annulla i contaminanti aerei, soprattutto i  miceti. Il personale addetto alla preparazione deve operare igienicamente e gli deve essere proibito  il passaggio tra locali esterni ed ambiente di  lavoro. Tutte queste attività, ovviamente, devono essere indicate più dettagliatamente nel manuale  HACCP  aziendale.

Riassunto.
Nel testo sono riportate una breve relazione sui batteri e miceti responsabili del rigonfiamento di alimenti confezionati refrigerati. Sono riportati anche dati sperimentali. I batteri responsabili sono risultati  soprattutto LAB etero fermentati e lieviti.

Summary
Role of bacteria and other microrganisms responsabile for the swelling of chile packaged foods.
A description  of swelling of the packaging of refrigerated foods end responsible bacteria and fungi have been reported in the text. Also,experimental data have been fournished. LAB eterofermentative bacteria and fungi have been reported.

Bibliografia
Bjorkroth J .& Holzapfel W.H. (2006)  Genera Leuconostoc, Oenococcusa and Weissella.In :Dworkin M.;Falkow S.& coll. The Prokaryotes,Springer New York
Hemme D. & Foucaud –Scheuneman C. (2004) Int.Dairy J. 14,467.494
Horwood J.F.; Stark W.& Hull H.H. (1987) Aust.J.Dairy  Technol. 42,25-26.
Johnson M.E. (2001) Cheese products. In : E.H.Marth & J.J. Steele (eds)Applied Dairy Microbiology pp . 345-384.M.Dekker,New York,ed.
Kim H .&Chun j. (2005)Int.J.Food Microbiol. 103,91-96
Ledenbach L.H. & Marshall R.T. (2009) Microbial spoilage of Dairy  products in:W.H.Sperber & Doyle M.P. Compendium  of  Microbiological Spoilage. Springer ed. Maki M. (2004)Lactic acid bacteria. In: Salminen A.; von Wright A. & Owehand A. (eds) Lactic acid bacteria  microbiological and functional aspects.M.Dekker eds.
Mundt J.O.; Graham W.F.&McCarty I.E.(1967)Appl.Env.Microbiol.15.12 03-1206.
Sade E. (2011) Leuconostoc spoilage of refrigerated foods. Univ.Helsinki

martedì 1 luglio 2014

Spreco alimentare e standard di qualità ed igienico sanitari



Carlo Cantoni Libero Docente Ispezione Alimenti O.A. , Milano
Stefano Ibba Medico Veterinario, Milano

Secondo la FAO (1981) si considera spreco di cibo la parte di tutti i prodotti commestibili destinati al consumo umano che è gettata via all’interno della filiera del valore aggiunto, va persa, si deteriora o è mangiata da parassiti.
In questa definizione sono compresi i cosiddetti rifiuti alimentari ossia ogni sostanza commestibile cruda o cotta che viene scartata o si intende scartare o è necessario scartare.
Nel 1975 la Commissione Europea diede la definizione legale di  rifiuti, valida negli Stati appartenenti all’Unione ”ogni sostanza od oggetto per il quale il proprietario elimina,o è costretto ad eliminare come previsto dalle leggi in vigore”.
Questa Direttiva (75/442)EEC fu emanata nel 1991 (91/150)con l’aggiunta delle categorie di rifiuti tra i quali sono compresi gli alimenti con data di scadenza superata.
Il 30 novembre 2011 in seguito alla relazione della Commissione per l’agricoltura e lo sviluppo rurale su come evitare lo spreco alimentare nella UE (2011/2175-INI) è stata pubblicata una proposta di risoluzione del Parlamento Europeo la quale, insieme ai pareri delle Commissioni ambiente-sanità pubblica-sicurezza alimentare, e mercato interno-protezione consumatori, definisce ”spreco alimentare l’insieme dei prodotti alimentari scartati dalla catena agroalimentari per ragioni economiche od estetiche o per prossimità della scadenza per il consumo, ma ancora perfettamente commestibili e potenzialmente destinabili al consumo umano e che, in assenza di un possibile uso alternativo, sono destinati ad essere smaltiti producendo esternalità negative dal punto di vista ambientale, costi economici e mancati guadagni per le imprese”-
Il 5 giugno 2013 il Papa Francesco in occasione della quarantunesima “Giornata sulla Terra” ha parlato di ambienti e di sprechi. Nell’udienza generale ha ricordato che la donna e l’uomo sono stati posti nel Giardino perché lo coltivassero e custodissero, come si legge nel secondo capitolo della Genesi, e ci ha invitato a chiederci che cosa significa coltivare e custodire: trarre dalle risorse del pianeta i beni necessari,con responsabilità, per trasformare il mondo in modo che sia abitabile per tutti, parole che già aveva usate da Paolo VI nell’enciclica “ Populorum progressio” nel 1967.
Papa Francesco ha detto che non è possibile custodire la Terra se, non solo le sue risorse, ma addirittura le donne e gli uomini “sono sacrificati agli idoli del profitto e del consumo”, alla”cultura dello scarto”.
Le ricchezze della creazione non sono di una persona,o di una impresa economica, o di un singolo paese,ma sono”doni gratuiti di cui avere cura” destinati ad alleviare soprattutto ”la povertà, i bisogni, i drammi di tante persone”. Il dramma più grave consiste nel fatto che un miliardo di persone manca di cibo sufficiente, in ogni parte di un mondo dominato dallo scarto, dallo spreco e dalla distruzione di alimenti.

Le cause degli sprechi nel ciclo distribuzione-consumo.

1)Cause che attengono alla coltivazione e al raccolto.
A)Paesi emergenti: Agricoltura su scala ridotta; Competenze tecniche, finanziaria e manageriali limitate; Raccolti prematuri dovuti alla necessità urgente di cibo o di realizzare i relativi proventi economici; Pratiche di raccolto spesso inefficienti o arretrate; Inadeguate dotazioni infrastrutturali.
B)Paesi sviluppati:Offerta superiore alla domanda; Standard qualitativi (estetici); Standard igienico-sanitari.

2)Cause che derivano dalla trasformazione industriale
Malfunzionamenti tecnici; Inefficienza nei processi produttivi (più spesso nei paesi emergenti).

3)Cause  legate alla distribuzione
Limiti della tecnologia impiegata per la conservazione dei prodotti,in particolare di quelli freschi; Danni ai prodotti in fase di trasporto e stoccaggio; Scorrette procedure di rotazione delle derrate; Accordi tra fornitori e distributori; Standard estetici di vendita; Strategia di marketing.

4)Cause connesse al consumo finale
Interpretazione data sull’etichetta; Scarsa o errata pianificazione degli acquisti; Inadeguata conservazione dell’alimento; Scarsa consapevolezza dell’entità degli sprechi.
Indicazioni della data di scadenza
Il superamento della data di scadenza e della durata di conservazione è considerato una causa importante dello spreco di cibo a livello di commercio al dettaglio e di economia domestica. La durata della vita commerciale dei prodotti alimentari è stabilita dal produttore ed è esplicitata con due definizioni: TMC e data di scadenza..
La definizione del TMC (o termine minimo di conservazione) indica la data fino alla quale il prodotto conserva le sue carattere specifiche in adeguate condizioni di conservazione, specificate eventualmente in etichetta. La dicitura da usare ”da consumarsi preferibilmente entro (giorno,mese e anno) oppure da consumare preferibilmente entro la fine di..(anno,o mese ed anni)”.
La data di scadenza sostituisce il  TMC nei prodotti confezionati rapidamente deperibili dal punto di vista microbiologico e che possono costituire dopo breve tempo,un pericolo per la salute umana(eventualità de tutto teorica ma creduta possibile). Per questi alimenti la dicitura da usarsi è”da consumarsi entro” e comprende, nell’ordine e in forma chiara, il giorno, il mese ed eventualmente  anche l’anno. Comporta l’enunciazione chiara delle condizioni di conservazione e ,qualora prescritto,un riferimento alla temperatura in funzione della quale è stato determinato il periodo di validità. E’ vietata la vendita dei prodotti che riportano la data di scadenza a partire dal giorno successivo a quello indicato sulla confezione.
Interventi per utilizzare alimenti in fase di scadenza

Con il fine di raccogliere e recuperare le eccedenze alimentari della produzione agricola e industriale e della loro redistribuzione a strutture caritative sparse sul territorio che svolgono attività assistenziale verso le persone più indigenti operano diversi enti e fondazioni come il Banco alimentare, il Last Minute Market, il Comune di Torino, il Pane quotidiano, I brutti ma buoni, Il buono che Avanza, l’Opera San Francesco ed altri ancora.
Il Banco alimentare ha iniziato la sua attività in Italia nel 1989 per iniziativa di Don Giussani,fondatore ed ideologo del movimento Comunione e Liberazione,e del Cav.Danile Fossati all’epoca patron dell’azienda alimentare Star. La fondazione onlus è affiliata alla Federazione Europea dei Banchi Alimentari (FEBA) e alla Compagnia delle Opere. La prima fondazione, o Food Bank, si forma agli inizi degli anni ’60 a Phoenix,in Arizona, con il nome di St Mary’s ,Food Bank,quando John Van Hengel comincia a distribuire ai bisognosi il cibo altrimenti sprecato da negozi e ristoranti. Attualmente in Italia sono attivi 21 Banchi alimentari. Basato sul concetto di dono e condivisione, l’attività del Banco alimentare di cui esistono esperienze analoghe in tutta Europa e Stati Uniti-si estrinseca nella raccolta-che avviene tramite l’AGEA, la speciale Agenzia per le erogazioni in agricoltura delle eccedenze di produzione agricola e industriale (specificatamente pasta,riso,olio d’oliva e latte). Tali eccedenze vengono poi redistribuite ai centri caritativi.

LAST MINUTE MARKET (Mercato all’ultimo  minuto). E’ una società spin off dell’Università di Bologna, nata nel 1998 sotto la supervisione di Andrea Segrè , e nel 2003 è diventata una realtà imprenditoriale su tutto il territorio nazionale con progetto volto al recupero di beni invenduti (o non commercializzabili) a favore di enti caritativi.
PANE QUOTIDIANO (sorella,fratello…qui nessuno ti domanda chi sei,né perché ne hai bisogno,ne quali sono le tue opinioni...). Inizia la sua attività  a Milano nel 1898 su iniziativa di Edoardo Banfi e di importanti cittadini milanesi, uniti dall’obbiettivo di assicurare ogni giorno e gratuitamente – a partire dalla classica”michetta”- cibo alle fasce povere della popolazione. E’una istituzione laica iscritta del 1908 all’IPAB.
OPERA SAN FRANCESCO PER I POVERI:Fu fondata nel 1959 dai Fratelli Capuccini di viale Piave in Milano. Offre assistenza gratuitamente ed accoglienza. Oltre a soddisfare ai bisogni primari e reali a persone in gravi difficoltà offre ascolto e protezione in virtù del fatto che fare del bene è il miglior modo per sentirsi bene.

Aspetti legislativi.
La legge n.155 del 25 giugno 2003” ha disciplinato la distribuzione dei prodotti alimentari a fine di solidarietà sociale ed è conosciuta come legge del” buon Samaritano”. L’Italia è stato il primo paese europeo a dotarsi di una legislazione di questo tipo;la norma prende spunto da un provvedimento legislativo statunitense, il Good Samaritan Food Donation Act del 1996, che favorisce la donazione di beni alimentari e specificatamente permette agli enti senza scopo di lucro di rifornire con facilità le mense per indigenti. Nella sua formulazione è composta da un solo articolo e comma.
“Le organizzazioni riconosciute come organizzazioni non lucrative di utilità sociale, ai sensi dell’art. 10 del decreto legislativo 4 dicembre 1997 n.460 e successive modificazioni, che effettuano, ai fini di beneficenza, distribuzione gratuita agli indigenti di prodotti alimentari, sono equiparate, nei limiti del servizio prestato, ai consumatori finali, ai fini del corretto stato di conservazione, trasporto, deposito ed utilizzo”.I  soggetti che possono usufruire di detta normativa sono le organizzazioni di volontariato, le Onlus, le organizzazioni non governative, gli enti ecclesiastici e le associazioni di promozione sociale.
Con la legge n.155 aziende, mense scolastiche,ristoranti supermercati non sono più responsabili del corretto stato di conservazione del trasporto,del deposito e infine dell’utilizzo degli alimenti,ma le responsabilità sono trasferite alle organizzazioni di volontariato. La legge del buon samaritano quindi equipara le Onlus ai consumatori finali.

La data di scadenza e i cibi scaduti

Le infrazioni alla data di scadenza sono 

1)l’alterazione volontaria del TMC e della data di scadenza;

2)Il superamento del TMC della data di scadenza in prodotta ancora in commercio.

Nel primo caso l’ipotesi di reato à la truffa, nel secondo , le ammende ed il sequestro. Per evitare di incorrere in tali spiacevoli evenienze i produttori, cautelativamente, sono costretti ad indicare sulle confezioni date di scadenze dei loro inferiori alle reali.
La tematica del destino dei prodotti alimentari ”oltre la scadenza” è stata molto presente negli ultimi anni nelle campagne e nelle discussioni sullo spreco del cibo. Secondo Andrea Segrè ,preside della Facoltà di Agraria alla Università di Bologna, le date di scadenza sono poco più di un artificio.
Su incarico della Commissione UE Eurobarometro ha chiesto a 25.500 intervistati di diversi popoli europei ”se fosse sicuro consumare prodotti alimentari dopo la data di scadenza riportata in etichetta”. Hanno risposto si il 14 % dei Romeni, il 22% dei Bulgari, il 26% degli Ungheresi, il 27% degli Italiani, il 27 % dei Polacchi,il 29 % dei Greci,il 36% dei Portoghesi, il 42% degli Spagnoli, il 47 % degli Estoni,il 47% dei Danesi,il 50 % degli Sloveni, il 51 % dei Lettoni, il 65 % dei Tedeschi, il 69% dei Lussemburghesi,il 73 % di Olandesi e Belgi, il 74% dei Francesi, il 75 % dei Finlandesi, l’81% degli Svedesi. Il primo elemento che si evidenza è  quello economico: gli intervistati dei paesi che soffrono di più per le difficoltà economiche sono quelli meno propensi a consumare cibi scaduti, quelli più propensi in assoluto sono invece i consumatori dei paesi del Nord Europa con una migliore situazione economica. Quindi ad un maggiore benessere economico corrisponde una maggiore cultura, maggiore interesse per l’educazione ambientale e dunque una maggiore consapevolezza sugli sprechi alimentari,anche di quelli dettati dalle leggi. Anche il Governo Greco nella situazione economico devastante  a consentito la vendita di prodotti che hanno superato il “Tempo Minimo di conservazione”. Il provvedimento non determina pericoli per i consumatori in quanto riguarda solo i prodotti non altamente deperibili e con un termine minimo di conservazione non strettamente  legato alla salute umana. Inoltre è stato previsto un limite “oltre scadenza”: la merce con giorno e mese di scadenza può rimanere in vendita per una settimana dopo la data stampata sulla confezione, quella con mese ed anno per un mese,mentre quella con un anno può rimanere negli scaffali per altri tre mesi. Tutto ciò conferma quanto ritenuto sull’argomento e da tanti altri come evidenziato dall’inchiesta citata.

Valutazione corretta della vita commerciale degli alimenti

Per molti alimenti  la data di scadenza è basata su valutazioni personali empiriche con la conseguente presenza nel mercato di prodotti simili con scadenze diverse ed,in genere, inferiori alla loro scadenza naturale. In molti altri la scadenza è valutata con prove idonee a valutarla con maggiore precisione. Secondo Porretta  (2010) si può intendere come shelf life, o vita commerciale di un alimento, in determinate condizioni di conservazione, il tempo limite entro il quale il progredire di singoli eventi reattivi determini modificazioni impercettibili, o comunque ancora accettabili, sul piano della sicurezza d’impiego.
La deperibilità è misurabile quando gli agenti responsabili,o i loro effetti, possono essere quantificati ed espressi in funzione del tempo. Nel corso della loro conservazione e distribuzione gli alimenti sono esposti a un elevato numero di fattori in grado di modificare le loro proprietà intrinseche; l’ossigeno, la luce, l’umidità sono solo alcuni di questi capaci di innestare reazioni di tipo degradativo tali da rendere inaccettabili dal consumatore i prodotti, e in casi più gravi (sebbene rari, n.p.)renderli  pericolosi.
Una delle pratiche più impiegate per lo studio della shelf life è quella di seguire nel tempo i cambiamenti di alcune caratteristiche qualitative (Marker).

Nella tabella n.1 seguente sono riportati i singoli alimenti ed i rispettivi indici (marker) di qualità.

Tab.1 Alimenti e indici di qualità
Cereali: comparsa visibile di muffa; oppure tempo necessario per la perdita di germibilità.
Frumento: sviluppo di anidride carbonica.
Farine: riduzione di valenza del pane ottenuto.
Cereali per l’infanzia : perdita vitamina C. 
Frumento, grano avena: produzione di esanale.
Cereali: tempo necessario per raggiungere l’umidità limite.
Snack fritti: tempo per raggiungere un punteggio negativo all’esame sensoriale.
Cereali secchi:  giorni per sviluppare la rancidità
Chips: Rancidità.
Noci con guscio o senza: rancidità
Pollame:1) crescita batterica.2) perdita ATP; 3) demolizione glicogeno,4)perdita ac.linolenico: 5) formazione di ipoxantina
Carne di maiale,vitello manzo; 1) odore:2) colore:3) conta batterica.
Carne di pesce:formazione di sostanze volatili.
Latte pastorizzato omogeneizzato: 1) conta batterica psicrotrofi; 2) tests sensoriali.
Polvere di latte magro: perdita valore proteico e perdita di lisina.
Latte condensato dolce: perdita di tiamina
Uova disidratate: e uova strapazzate:perdita di vitamina A.
Margarine:perdite di vitamina A.
Vegetali surgelati:perdita vitamina C.
Frutta surgelata: 1) Perdita clorofilla; 2)perdita vitamina C; 3) stabilità del ngusto; 4) stabilità dell’aroma.
Vegetali inscatolati: 1) perdita vitamina C; 2) perdita tiamina; 3) perdita riboflavina; 4) perdita carotene.
Conserve di pomodoro (concentrati) formazione di idrossimetilfurfurale (HMF)
Frutta inscatolata: perdita di tiamina e di vitamina C,

Rispetto a questi sistemi il metodo migliore per valutare con esattezza la vita commerciale di un prodotto alimentare resta comunque la valutazione tramite l’analisi sensoriale. Questa è una disciplina scientifica che consiste nella valutazione delle caratteristiche di un prodotto (di qualsiasi natura esso sia) attraverso gli organi di senso (vista,udito,olfatto gusto e il tatto). L’unico inconveniente limitante la determinazione della data di scadenza è dovuto al suo costo che ostacola la sua esecuzione.

Conclusioni.
Secondo i dati di uno studio della Commissione UE( 2011) la produzione di rifiuti alimentari nei 27  Stati membri assomma circa 80 milioni di tonnellate annue, ossia 179 kg pro capite, con un’elevata variabilità fra i singoli paesi e vari settori, senza contare gli sprechi a livello di produzione agricola o le catture di pesce rigettate in mare. In Italia ogni anno si gettano 8,7 miliardi di euro e lo spreco settimanale per famiglia è di circa di 213 g di cibo per un costo di 7,06 euro per settimana (Rapporto Wast Watcher 2013 sullo spreco alimentare). Tutto ciò dimostra la necessità di intervenire a ridurre gli sprechi in quanto ciò che finora di fa in proposito è insufficiente come il Parlamento europeo ha sottolineato con la risoluzione del 19 gennaio 2012 dedicata a come risolvere lo spreco di alimenti indicando le strategie per migliorare la catena alimentare nella Ue (2011/2175 (INI).

mercoledì 18 giugno 2014

Micobatteri, alimenti e sicurezza alimentare


Carlo Cantoni, libero docente in ispezione degli alimenti di origine animale Milano

I micobatteri sono bacilli immobili, non sporigeni, aerobi obbligati. Possono formare sferoplasti e sono acido resistenti. Costituiscono il genere Mycobacterium, famiglia delle Mycobacteriaceae, ordine Actynomycetales. Il genere Mycobacterium include il complex M.tubercolosis, il complex M.avium, il gruppo M.chelonae e altri micobatteri patogeni e non patogeni presenti nel terreno e nelle acque.
Il complex Mycobacterium tubercolosis comprende: M. tubercolosis, M. bovis, M.a fricanum, M. cannetti, M. caprae e M. microti (Bosch &coll 2002) e il complex  M. avium include: M.a vium ssp. avium, M.avium ssp hominisuis, M. avium ssp. paraubercolosis, M. intracellulare (Mijs & coll.2002), M. chimerae e M. silvanus. Altri micobatteri patogeni sono M. fortuitum, M. chelonae, M. marinum, M. kansassi e M. scrofulaceum (Olsen& coll.2010). I micobatteri non inclusi nel complex M. tubercolosis sono denominati MOTT (micobatteri diversi dai bacilli tubercolari).

Patogenicità dei micobatteri e risposta dell’ospite.

Lo  sviluppo di una malattia da micobatteri in un ospite dipende dalla possibilità del micobatterio di sopravvivere e di moltiplicarsi entro i macrofagi dell’ospite (Olsen & coll.2010). I micobatteri patogeni  producono lesioni granulomatose in un  ampio numero di specie animali quali mammiferi, uccelli, rettili, pesci e  anfibi. La patogenicità dei micobatteri è un evento polifattoriale richiedente  la partecipazione e  gli effetti cumulativi di parecchi componenti cellulari (Olsen & coll.2010). I micobatteri sopravvivono nei macrofagi non attivati inibendo la fusione di fagosomi e lisozomi, evitando la generazione di ossigeno attivo e di intermediati nitrosici o localizzandosi nel citoplama (Olsen &coll.2010). La parete cellulare dei micobatteri, composta da peptdoglicano, arabinogalattano, da acidi micolici, il Cord factor (trealosio 6,6-dimicolato) e altri acidi micolici con glicolipidi sono coinvolti nella patogenesi delle malattie da micobatteri. I glicolipidi e i glicolipidi solforati permettono la sopravvivenza dei micobatteri virulenti  entro i  macrofagi inibendo il fagosoma. Numerosi fattori dell’ospite sono associati alla resistenza dell’ospite nei confronti dell’azione patogena dei micobatteri: i macrofagi, che sono il principale fattore antagonista, (Russell & coll .2010),le cellule CDT secernenti interferone gamma,le cellule CD8T che distruggono i micobatteri mediante la produzione di granulolisina (proteine  antimicrobica), varie citochine attivanti le funzioni dei macrofagi e limitando la replicazione dei micobatteri. Altri fattori  antimicobatteri possono essere i composti intermedi azotati ( p.e. ac.nitroso), l’ossigeno singoletto e gli anioni superossidi n prodotti da macrofagi (Olsen & coll.2010).

Malattie associate con micobatteri del complex Mycobacterium avium.

Del gruppo MOTT fanno parte micobatteri isolati da numerose fonti(Thoren 1981;Olsen & Coll.2010). I batteri del complex Mycobacterium avi & coll,um sono stati isolati da carni di suino e di altri animali da cibo (Komjin & coll.1999; Thoen 2010; Olsen & coll 2010,Wellenberg & coll.2010). Questi microrganismi sono stati spesso isolati da acque, liquami di fogne, vegetali decomposti e da altri fonti ambientali (Kazada,1979;Matlova  & coll.2004). Il micobatterio di maggiore importanza per la salute pubblica del complex Mycobacterium avium è il M.avium ssp.paratubercolosis (MAP). MAPP è stato isolato da latte in polvere e da formaggi (Grant & coll..2002;Ayele  coll.2005;Slana  coll.2008) e da latte pastorizzato; recentemente è stato isolato da guanciali bovini (Okura & coll.2011). Esistono anche dimostrazioni  della resistenza di MAP al trattamento di pastorizzazione HTST, sebbene questo risultato sia controverso (Vaerewijck & coll.2005). Diversi ricercatori hanno, inoltre, potuto isolare il MAPP da pazienti  con la Crohn disease, ma  altre ricerche non hanno fornito la prova necessaria  per ritenere MAP l’agente eziologico della malattia di Crohn (Qual &coll.2010,Van Kruningen & coll-2011). Una considerazione importante da tenere presente è l’elevata resistenza all’acidità dello stomaco  e ai Sali biliari  con conseguente aumento della sopravvivenza del batterio nell’intestino umano dopo l’ingestione per via orale (Primm & coll.2004sono stati isolati). Inoltre e in aggiunta, MAP e altri micobatteri del complex M.avium  sono stati isolati da esseri umani affetti da infezione HIV e da  altri soggetti immunocompromessi (Primm & coll.2004). Recentemente Cossu  & coll.2011) hanno pubblicato uno studio nel quale ritengono che il MAPP possa essere una possibile concausa della sclerosi multipla, mentre Dow (2012) ritiene che svolga un ruolo nella patogenesi del diabete1 autoimmune dell’essere umano.

La malattia nell’uomo (Malattia di Crohn, morbo di Crohn).

Ci sono indizi secondo i quali il MAP è implicato nella causa della malattia infiammatoria intestinale detta morbo di Crohn. Il MAP può essere riscontrato in molti pazienti affetti da questa malattia e anche nei bovini ll MAP causa una infiammazione intestinale cronica, la paratubercolosi. Anche le infezioni virali possono favorire lo scoppio di questa malattia intestinale infettiva. La malattia è evidenziata dall’ infiammazione dell’intestino tenue e dell’intestino crasso. I sintomi consistono in irregolarità nella defecazione,gravi diarree con  perdita di muco, dolori al ventre, nausea, vomito e occlusione intestinale. Spesso vengono descritti sintomi generali come perdita di peso, stanchezza e infiammazioni in altre parti del corpo. La componente più rilevante della malattia è la sua predisposizione genetica. Il 35 % di tutti i pazienti affetti da morbo di Crohn presentano una mutazione nel gene NOD2)CARD15 che determina la difesa da sostanze tossiche prodotte da batteri intestinali.

La malattia nel bovino. 

MAP è la causa di una malattia intestinale trasmissibile dei ruminanti comunemente conosciuta come Johne‘s disease (malattia di Johne o paratubercolosi. La malattia colpisce prevalentemente gli animali giovani (con meno di 30 giorni di età)per via fecale-orale; altre vie di contaminazione sono la via placentare e la via intrauterina. Dopo un periodo di incubazione di 2-5 anni (periodo di intervallo constatato tra 6 mesi e 8 anni) gli animali sviluppano può essere presente depressione del sensorio, inappetenza e arresto della  ruminazione, pelo ispido, dimagramento e diarrea intermittente, edema ventrale, debilitazione e morte. La paratubercolosi è caratterizzata dalla infiammazione granulomatosa delle parti terminale dell’intestino tenue e del crasso e delle linfoghiandole regionali. Clinicamente la malattia di Johnes comporta disturbi funzionali dell’intestino associati a reazioni infiammatorie. Nei bovini, le lesioni sono localizzate principalmente sulla parete intestinale e si caratterizzano come diffusi granulomi con poca o nessuna necrosi visibile. I granulomi contengono numerosi bacilli acido resistenti, spesso presente anche nei linfonodi del tratto intestinale infetto. E’ stata osservata necrosi caseosa nelle lesioni intestinali  di pecore e di capre.

Eliminazione tramite il latte di MAP.

Come riportato in precedenza il MAP può contaminare il latte prodotto da bovine affette da paratubercolosi-. Il MAP  può trovarsi anche nel latte di bovine senza segno di malattia, ma portatrici di infezioni subcliniche. La contaminazione del latte  ha origine fecale. Di solito  i MAP  nel latte contaminato sono poco numerosi. Il problema legato alla presenza dei MAP nel latte trattato con le temperature normali di pastorizzazione è dovuto alla  loro termoresistenza. Per  ottenere la distruzione dei MAP nel latte pastorizzato  lo si deve sottoporlo a uno dei due trattamenti termici  in uso nel Regno Unito trattandolo a 72° C per 25 secondi o a 90°C per 15 secondi.

Controllo della paratubercolosi

 Considerato che : A) in alcuni paesi comunitari ad elevata vocazione lattifera (Danimarca, Olanda, Spagna, Austria) sono già in atto programmi sanitari finalizzati a ridurre l’incidenza della malattia negli allevamenti bovini. B) in alcuni Paesi terzi (Australia, Canada, Cina, India) consentono l’importazione di formaggi prodotti in Italia a condizione che gli allevamenti di provenienza del latte impiegato per la produzione di formaggi abbiano garanzie sanitarie supplementari nei confronti della paratubercolosi; C)  la produzione di latte bovino rappresenta una importante fonte di reddito per il settore primario in Lombardia dove viene prodotto il 40 % del latte italiano; D) la Paratubercolosi bovina determina rilevanti danni economici diretti negli allevamenti bovini, anche in assenza di forme cliniche di malattia e comporta la limitazione del commercio dei prodotti a base di latte destinati alle esportazione, la Regione Lombardia, già dal 2013 con D.d.g. del 18 luglio 2013 ha elaborato un Piano Regionale di controllo e certificazione nei confronti della paratubercolosi bovina indicando la rispettiva linea guida. Considerando che non è proponibile imporre l’applicazione di temperature più elevate mancando la certezza tra presenza del micobatterio e sua partecipazione alle lesioni del morbo di Crohn, per garantire l’assenza del  MAP nel il piano regionale è finalizzato a : 1) rendere obbligatoria la  segnalazione dei casi clinici nei bovini e l’adozione dei provvedimenti conseguenti; 2) fornire agli allevatori idonei strumenti per prevenire e limitare la diffusione dell’infezione negli allevamenti; 3) definire i criteri per rilasciare le attestazioni sanitarie (certificazioni) degli allevamenti,ai fini del commercio del latte e dei prodotti derivati ; 4)monitorare la diffusione dell’infezione nella popolazione bovina della Lombardia. Tale piano è attualmente in fase di esecuzione.

Conclusioni

Morbo di Crohn, Sclerosi multipla e diabete autoimmune 1 sono ritenute malattie genetiche autoimmuni con cause multifattoriali tra  le quali quelle batteriche. Il MAP  sopratutto, in seguito alla possibile presenza nel latte e derivati  e per essere stato isolato dalle lesioni umane ,tenendo conto delle somiglianza delle lesioni intestinali  umane della malattia di Crohn  con quelle  della paratubercolosi bovine stato ritenuto in grado di svolgere attività aggravante le lesioni mucosale. La fonte del MAP è stata identificata nel latte. Oltre al MAP altri studi hanno associato alla malattia specifici ceppi di Escherichia coli enteroaderente: in particolare il ceppo aderente invasivo (AIEC) è più comune nelle persone affette dalla malattia di Crohn produce, rispetto alle specie non enteroaderenti, biofilm più  potenti che impediscono l’autofagia durante la fase autolisosomiale, garantendo la sopravvivenza dei batteri intracellulari e l’induzione della infiammazione. Questa promuove la proliferazione dell’AIEC e la disbiosi dell’ileo. I ceppi AIEC si replicano estensivamente all’interno dei macrofagi ed inducono la secrezione di TNF Alfa (fattore di necrosi tumorale). Altri batteri chiamati in causa sono L.onocytogenes  e Y.enterocolitica. in apparenza c’e’ un collegamento tra la malattia di rohn , MAP e altri batteri patogeni e marcatori genetici. In diverse persone, fattori genetici predispongono diversi individui all’infezione da MAP. Questo batterio produce mannani che proteggono la fagocitosi esso stesso e diversi altri batteri causando infezioni secondarie. Le  relazione tra determinati tipi di batteri  con malattia di Crohn, sclerosi multipla e diabete tipo 1 rimangono oscura, nella prima malattia, e devono  essere riconfermata nelle  seconde.

Riassunto

Nel testo sono riportati i rapporti esistenti tra la presenza di Mycobacterium avium ssp.paratubercolosis nel latte e in altri alimenti con la patogenesi di malattie umane autoimmuni quali il morbo di  Crohn,la sclerosi multipla e il diabete tipo 1.
Summary
Mycobacteria,animal foods ad food safety
In this text the  known relations of the M.paratuberolosis presence in animals foods and some autoimmune human diseases have been reported .the Human diseases    with  Mycobacterium  paratubercolosis presence are:the Crohn’s diseases,multiple sclerosis and diabetes type 1.

Bibliografia
Abdenahuran C. ;Cesaro A.;Mirouna S.& coll.(2012)Plos.DOI:10:1371
Ayele W.Y. ; Svastova P.; Roubal  P.& coll.(2005) Appl.Enviro.Microbiol.71,1210-1214.
Baumgard M.;Dugan B.Rishniw M. & coll. (2007) ISME journal 52,403-418
Cossu D.; Cocco E,;Paccagnini P. & coll.(2011) Plos,one 6/4e 18482 doi : 10.1371 J-
Brosch R.;Gordon S.V.; Marmiesse M. & coll.(2002)  Proc.Natl.Acad.Sci,USA  99,3684-3689.
Decostere A.K.; Hermans  K.& Haesbrouck F.(2004) Vet.Microbiol. 99,159-166.
Densmore C.L.& Green D.E. (2007).ILAR J.48:235-254.
Dow C.D. (2012) J:diabetes Mellitus 288-295.
Dvorska L.; Bartos M.;Ostadl O. & coll.(2002) J.Ciin.Microbiol. 40.3712-3719
Grant I.R.:Ball H.J.& Rowe M.T. (2002) Appl.Environ.Microbiol.68,2428-2435.
Kazada  J.(1979)Colloque Int sur le Mycobacterie Lyon France  pp.318-327.
Komijn R.E.; de Hass P.E.W.;Schneider T.& coll.(1999) J.Clin.Microbiol.5318-5325.
Matlova L.;Dvorska K:;Palecek K. & coll.(2004) Vet.Microbiol.102,227-236.
Mijs W.; de Haas P.; van Der  Larn T: & coll. (2002) Int.J.Syst.Evol.Microbiol.52
1505-1518.
Okura H.; Toft N.;Pozazato N.; Tondo A. & coll.(2011)Vet:Med.Intern.152867.
Olsen L.:Barletta R.G & Thoen C.O.(2010) Mycobacterium.In :Gyles C.L; Prescott J.F.;Songer J.G. &Thoen C.O. (eds) Patogenesis of Bacterial infections in Animals.Wyley/Blackwell,AMES,USA,pp 113-132.
Primm T,P.; Lucero C.A. & Falkinham III.(2004) Clin.Microbiol. Rev. 17,98-106
Qual  D.A.; Kaneene J.B.;Varty  J.B. & coll. (2010) J.Dairy Sci.93,2371-2376.
Russell D.G. ; Barry C.E. & Flynn  J.L- (2010) Science 328,852-856
Slana I.F. ;Paolicchi B.; Janstova P & coll.(2008) Vet.Med, 53,283-306.
Soldati  G. ;Lu Z.H. ;Vaughan A. & coll.(2004) Vet.Pathol. 41,388-397.
Tell  L.A. :Woods  L. & Cromie R.L. (2001) Rev.Sci.Tech.20,180-203.
Thoen C.O. & Karlson A.G. (1984) Experimental tubercolosis in rabbits. In:W Kubica G.P. and  Wayne  L.C (eds),The Mycobacteria s Sourcebook.Marcel Dekker inc.new York andbasel pp. 978-989.
Thoen C.O. (2007) Johne’s Diseases.In: Geller L (ed), Mc Graw-Hill Encyclopedia of Science  & Technology 10th edition. Mac Graw  Hill Publishing,New York Usa 9.515-516.
Thoen C.O. (2010)Tubercolosis and other  mycobacterial  infections.In : Kahn C.M. and Line  S. (eds),The Merck Veterinary Manual:10th ed.,Merck & Inc. Whitehouse Station N.J.pp 621-663.
Van  Kruningen H.J. (2011) J.Crohn’s and Colitis 5,638-644.

Wellenberg G.J.; de Hass P.E.W.; van Ingen J. & coll. (2010) Vet.Rec.167,451-454.

giovedì 29 maggio 2014

Considerazioni sul trattamento delle carcasse bovine e di pollame mediante l’uso di sostanze antibatteriche

Carlo Cantoni, libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale, Milano

Stefano Ibba, medico Veterinario, Milano

Per limitare  o per escludere la  presenza di germi patogeni nelle carni macellate, da tempo, in diversi paesi si è ricorso alla decontaminazione delle carcasse bovine e di pollame all’impiego di composti chimici. Ad esempio negli USA è permesso il trattamento delle stesse con antimicrobici approvati dalle autorità sanitarie (Food and Drug Administration e United States Department of Agriculture USDA) quali: il sodio clorito acido, il bromo, il diossido di cloro, il cetilpiridinio cloruro, alcuni acidi organici, l’ac.peracetico (PAA), il fosfato trisodico, il metasilicato di sodio, la monocloroammina, l’acqua elettrolizzata e l’acido ipocloroso (Mac Kee 2012).  Questi trattamenti  sono stati applicati in base ad un programma governativo avente lo scopo di ridurre il numero dei germi patogeni presenti sulla superfici delle carcasse e, quindi, delle carni derivate ed anche, contemporaneamente di limitare la presenza dei batteri deterioranti. La necessità di limitare i germi patogeni è dovuta alle modalità alimentari e culinarie in uso in quale nazione nella quale si rende necessario ridurre gli episodi di tossinfezioni alimentari dei quali sono ritenuti responsabili carni  cotte insufficientemente. Viceversa, in Europa, la refrigerazione è sempre stato il metodo principale per il controllo dei germi patogeni e dei deterioranti. Ora, in seguito alla emanazione del Reg.(UE)  n.101/2013, anche i macellatori europei possono trattare le carcasse bovine con acido lattico e,in  conseguenza dello stesso Regolamento, gli Stati Uniti possono aumentare la quota di esportazione delle loro carni non trattate con ormoni in Europa.  
Germi patogeni e deterioranti presenti su carcasse bovine e di pollame.

GERMI PATOGENI. L’importanza delle carni come fonte di patogeni dipende dal grado di contaminazione alla macellazione, da quello delle successive fasi di lavorazione (sezionamento e porzionamento) dalla possibilità di loro moltiplicazione durante la conservazione e, soprattutto, dall’osservazione di norme igieniche (HACCP) e di operazione eseguite secondo le cosiddette GMP, o pratiche di buona lavorazione. E’ doveroso sottolineare che le tossinfezioni conseguenti al consumo di carni è dovuto alla loro cottura insufficiente. Per inattivare i germi patogeni e di quelli necessario è sufficiente riscaldare le carni (a cuore) alle seguenti temperature; A) Carni di pollo e tacchino73°C; B) Carni trite, salsicce  68,3°; C) Bistecche, pesce. 62,8°C; D) Riscaldamento di alimenti carnei già cotti 73,9. I principali germi patogeni contaminanti sono: salmonelle spp; E.coli O157 H7, E.coli enteropatogeni, E.coli extraintestinali, Campylobacter. Nelle carcasse e nelle carni bovine possono talvolta trovarsi E.coli O157 H7 ed E.coli enteropatogeni mentre raramente lo sono altri patogeni. Nelle carcasse di pollo prevalgono le salmonelle spp. gli E.coli enteropatogeni. Gli E:coli patogeni extraintestinali e, soprattutto, le Campylobacter. L’E.coli O157:H7 è un microrganismo verocitotossico (VT) enteroemorragico (EHEC), i bovini e altri ruminanti sono portatori asintomatici ed eliminatori. I coli enteropatogeni sono raggruppati in 6 patotipi. I coli patogeni extraintestinali(ExpEC) causano infezioni extraintestinali nell’essere umano come infezioni del tratto urinario, setticemie, sepsi neonatali e meningiti e più raramente, polmoniti. La popolazione di questi E.coli è raggruppabile in 5 gruppi filogenetici A,B,B2, D. Principalmente i ceppi del gruppo B2, in numero minore al gruppo D e posseggono fattori di virulenza quali: adesine, lipopolisaccaridi, capsule, siderofori, proteasi, siero resistenza e producono tossine. I sierotipi responsabili di infezioni umane presenti nelle carni di pollo (denominati APEC=avian pathogenic E.coli) appartengono ad uno stesso sierotipo (O2:K1;O 18 :K1:O:78)  rappresentando quindi un rischio potenziale per il consumatore.
Le salmonelle nelle carne di bovino sono raramente presenti (S.dublin) mentre  possono spesso  localizzarsi nelle carni di pollo. In queste sono stati solati vari sierotipi: S. typhimurium, S. typhimurium monofasica, S .dublin, S. rinsen, S. Saint Paul. Da queste carni è frequente l’isolamento di ceppi del genere Campylobacter. Nel corpo umano i Campylobacter causano, dopo pochi giorni dall’infezione, febbre, mal di ventre e diarrea. In genere l’infezione non è pericolosa  ma negli ultimi tempi il numero dei casi in Europa è aumentato. I microrganismi si localizzano nel tratto intestinale di polli sani ed è diffuso in tutto il mondo. Al momento della macellazione degli animali non sempre si può evitare la contaminazione della carne. I Campylobacter si riscontrano nella carne cruda o insufficientemente cotta  di pollame. Per provocare l’infezione si ritiene siano sufficienti l’assunzione di 500 patogeni. Tra le malattie gastroenteriche di origine batterica degli umani la Campylobacteriosi è la più frequente. Nella maggior parte dei casi (90%) i Campylobacter sono batteri spiraliformi  che si muovono con un flagello. Si moltiplicano nell’intestino e vengono eliminati con le feci. L’ambiente ottimale per la loro crescita è a temperature intorno ai 42°C: con temperature superiori a 60°C muoiono. Il congelamento danneggia le cellule e riduce il numero di questi patogeni.

GERMI ALTERANTI. La popolazione batterica deteriorante è composta da germi psicrotrofi principalmente del genere Pseudomonas. Sono anche presenti Acinetobacter e Psycrobacter. Altri batteri,come ad esempio Brochotrix thermosphacta, si trovano in numero limitato e solo occasionalmente costituiscono una parte significativa della popolazione batterica alterante.
Impiego di acidi organici per la decontaminazione batterica delle carcasse di bovino e pollo.
Soluzioni di acidi organici (1-5%) come ac. Lattico, acido  acetico sono state quelle iù usate nei macelli statunitensi, australiani e nuovo zelandesi per la decontaminazione di carcasse (mezzene) bovine ed ovine. Diversi sperimentatori hanno constatato l’effettiva diminuzione di E.coli e di altri batteri contaminanti spruzzando acidi organici (lattico, acetico e proponico) direttamente su di esse o immergendole nelle loro soluzioni alle concentrazioni indicate prima (Ramirez & coll,1999; Ramson & coll.2003; Gill & coll.2003; Dubal & coll. 2004).
Si pensa che l’azione antibatterica sia dovuta alla penetrazione nella cellula batterica dell’acido indissociato il quale, abbassando il pH, attiva nei microrganismi dei processi di regolazione che consumano molta energia indebolendo la cellula. Gli acidi, inoltre, inibiscono l’attività di determinati sistemi enzimatici, come, per esempio, quelli necessari alla replicazione del DNA. Ciò fa sì che il microrganismo non possa più riprodursi. Il terzo effetto sarebbe dovuto alle molecole  degli acidi presenti all’esterno della cellula batterica che danneggiando la struttura proteica della membrana compromettono la permeabilità a sostanze minerali come sodio e potassio. La conseguente modifica della pressione osmotica della cellula, infine, determinerebbe infine la necrosi della cellula. Vi sono prove evidenti che il trattamento con acidi organici aumenti la vita commerciale delle carni confezionate sottovuoto o in atmosfera modificata allungando la  durata della lag fase dei batteri (Podololak & coll.1996).
Requisiti principali del Reg, UE n101/2013 relativo all’impiego di acido lattico per ridurre la contaminazione superficiale delle carcasse di bovino.
In base a quanto stabilito nel Regolamento le condizioni di impiego dell’acido lattico  sono:
1) Le soluzioni di acido lattico devono essere preparate a partire da acido lattico conforme alle specifiche stabilite dal Regolamento (UE)n.231/2012.
2) Le soluzioni di acido lattico devono: A) essere applicate solo su carcasse, mezzene o quarti di animali domestici della specie bovina (comprese le specie Bubalus e Bison) a livello del macello. B) essere applicate solo mediante spruzzatura o nebulizzazione utilizzando soluzioni   al 2-5% di acido lattico in acqua potabile a temperature fino a un massimo di 55°C. C) essere applicate in condizioni controllate e verificabili integrate in un sistema di gestione basato sul sistema HACCP che includa almeno i criteri di cui alla parte II. 
3) Le soluzioni di acido lattico non devono essere applicate alle carcasse con contaminazione fecale visibile.
4) L’applicazione di soluzioni di acido lattico non deve comportare modifiche fisiche irreversibili delle carni.
Parte II Criteri e parametri di controllo HACCP minimi.
1) Il campionamento delle carcasse, ai fini della valutazione del rispetto dei criteri microbiologici ai sensi del Reg.(CE)n.2073/2005, deve essere effettuato prima delle applicazioni delle soluzioni di acido lattico su carcasse, mezzene o quarti.
2) La concentrazione di acido lattico durante il trattamento, in quanto parte del piano HACCP, deve essere verificata mediante monitoraggio periodico, documentata e registrata.
3) La temperatura della soluzione di acido lattico durante il trattamento in quanto parte del piano HACCP deve essere monitorata costantemente con misurazioni strumentali, documentata e registrata.
Utilizzazione di acido peracetico su carcasse di pollame e  carne rossa.
Come ha eccellentemente precisato Ferri (2014), il Reg. (CE) 853/2004  per carni di pollame si devono intendere solo quelle idonee al consumo umano, che non hanno subito alcun trattamento diverso dal trattamento a freddo. Viceversa negli Stati Uniti è possibile trattare le carni di pollame con quattro antibatterici: biossido di cloro, cloruro di sodio acidificato, fosfato trisodico e per ossiacidi.
Queste sostanze vengono ritenute innocue da FDA e USDA. Considerato il notevole sviluppo del settore della produzione delle carni avicole negli Stati Uniti e delle enormi possibilità commerciali verso l’UE, il divieto europeo costituisce un serio ostacolo alle esportazioni negli scambi commerciali tra i due paesi(Ferri 2014) e, in base ai principi statunitensi, qualsiasi restrizione o limitazione allo scambio commerciale (importazione di prodotti e di animali) tra i paesi aderenti  ai cosidetti “negoziati di equivalenza” tra UE e USA non può essere impedita purché la salubrità dei prodotti oggetto di import/export sia assicurata scientificamente. Per  avere, quindi, la possibilità di esportare carni di pollame il Dipartimento dell’Agricoltura degli USA (USDA) ha presentato la documentazione richiedente l’impiego di soluzioni di acido perossiacetico destinate ad essere impiegate dagli operatori agro-alimentari. Nel corso della trasformazione, per la riduzione dei patogeni nelle carcasse e le carni avicole, in seguito alla richiesta della Commissione Europea, è stato richiesto all’EFSA di valutare la sicurezza e la efficacia di soluzioni di acido acetico destinate ad essere impiegate per soluzione  la riduzione dei patogeni sulle carcasse e carni avicole esaminando:
· La sicurezza tossicologica della sostanza.
· L’efficacia, cioè se l’impiego della sostanza riduce, in modo significativo, il livello di contaminazione dei patogeni sulle carcasse e carni avicole.
· La possibile comparsa di una riduzione di sensibilità ai biocidi e/o della resistenza agli antimicrobici terapeutici, legata all’uso della sostanza.
· Il rischio connesso all’impiego della sostanza nell’ambiente.
La sostanza, oggetto della sperimentazione è una soluzione acquosa contenente acido perossiacetico (PAA) come principio attivo. La soluzione, inoltre, contiene anche perossido d’idrogeno (acqua ossigenata) e acido 1-idrossietilidiene -1.1-difosfonico (HEDP) come stabilizzante del prodotto. In alcune miscele è aggiunto anche acido ottanoico con il ruolo di tensioattivo. Per la precisione,la richiesta richiede l’impiego del PAA su: 1)carcasse o parti delle stesse calde (preraffreddamento), 2) sulle carcasse in bagni di raffreddamento (raffreddamento). 3) su carcasse o parti delle stesse post raffreddate (post raffreddamento).
Il PAA può essere applicato anche come lavaggio mediante nebulizzazione o immersione, secondo la fase nella linea di lavorazione. La concentrazione del principio attivo utilizzata non deve superare 2.000 ppm nei bagni a breve termine, (3 minuti), e fino a 230 ppm nei bagni refrigeranti di lunga durata (esposizione durante il raffreddamento 1-2 ore)
La concentrazione nei lavaggi per irrorazione è tipicamente di 400-700ppm, per 10 secondi. La temperatura massima è quella ambientale ed il pH di una soluzione di 600 ppm è approssimativamente 2,5. Non è prevista una rimozione successiva delle soluzioni di PAA dalle carcasse e dalle carni avicole. Il PAA si dissocia molto rapidamente scindendosi in acido acetico ed acqua.
Il 6 marzo 2014 l’EFSA ha pubblicato il parere scientifico sull’argomento così  sintetizzato: 1) il trattamento con acido peracetico non conduce al rischio di tossicità legato a possibili prodotti di reazione del perossido d’idrogeno e  perossiossiacidi  con lipidi e proteine delle carcasse e carni di pollame. 2)è improbabile il rischio della comparsa di resistenza o di ridotta sensibilità ai biocidi e agli antibiotici. 3)non esistono rischi per la sicurezza dell’ambiente dovuta ai vari componenti della soluzione, fatta eccezione per HEDP, la cui fuoriuscita. 4) i alla nebulizzazione. 5) i piani di HACCP devono comprendere il monitoraggio della concentrazione di HEPD nella soluzione di lavoro  e la sorveglianza post-marketing per la resistenza antimicrobica ed antibiocida nei batteri patogeni e commensali. Questa opinione scientifica conferma quanto già si conosceva su questo modo di comunicazione descritto in dettaglio nei documenti  statunitensi ed è quindi solo una conferma dell’ovvio. Comunque costituisce la base scientifica per la eventuale adozione di un regolamento della Commissione come già avvenuto per le carni bovine.

Conclusioni

Dall’attenta consultazione del testo del Reg.101/2073 si evince che tale procedura non sarà verosimilmente mai adottata nel nostro paese perché le modalità di distribuzione della soluzione sanificante e la  serie di controlli batteriologici e chimici  la rendono economicamente improponibile. Il Regolamento è un espediente per permettere l’importazione delle carni dagli USA in Europa e  a nient’altro. La stessa affermazione vale nel caso di emanazione di un regolamento per la carne di pollame. Le precisazioni comportamentali ed i controlli analitici  presumibilmente imponibili in base a quanto riportato nel parere dell’EFSA eleveranno in modo insostenibile i costi della macellazione e distribuzione dei prodotti avicoli. Incredibile, inoltre la richiesta di verificare l’eventuale formazione di batteri resistenti ad antibiotici e biocidi. Proposta incredibile, da elencare tra i vari e numerosi euromiti. Fortunatamente nel nostro Paese, come in Europa. La  macellazione viene condotta con il corretto e sapiente impiego della refrigerazione e delle buone pratiche igieniche di lavorazione che forniscono carne igienicamente rispondente ai requisiti igienici. E’vero che le carni di pollo possono essere contaminate da batteri patogeni, ma  i rari episodi verificatisi sono stati provocati da umidi di carne di tacchino  consumati in mense, mantenuti a temperature superiori a 8° C e contenenti ceppi di Clostridium mentre non sono mai stati segnalati episodi causati da batteri patogeni non sporigeni.

Riassunto

Nel testo sono riportate  considerazioni sui trattamenti di decontaminazione delle carcasse e carni di bovino e di pollame ed è sottolineata la maggiore importanza dell’uso del freddo come garanzia della salubrità delle carcasse e delle carni derivate.
Summary On the bovine and poultry carcasses  organic acids.
In the text considerations have been reported on the bovine and poultry carcasses   and derived   meats with peroxydacid.The better  efficacy of cold treatment of these products has been outlined.

Bibliografia

Dubal Z.B.;Patriszka A.M.; Woskar V.S. & coll. (2004) Meat sci. 86817-821
Efsa (2014) Efsa Journal 12 (3; 3599-4199opener)
Gill C.O. & Landers C. 2003 Meat sci. 651005-1011
Mc Kee S. 2012 65th American Meat congr. 14
Podolak R.K.; Zayas J.F.; Kashner J.F. & fung D.Y.C. (1996) J FOOD PROT 59,1037-1040
Ramirez A. J.; Acuff J.; Lucia G.R. & Coll (2001) J FOOD PROT 64,1439-1441
Ramsom J.; Belk K.E.; Sofus E. & Coll (2003) FOOD PROT. TRENDS 23,24-34


lunedì 31 marzo 2014

Attività antibatterica di ac. laurico, monolaurina e lauroilarginato



Spezie, olii essenziali, acido laurico e suoi derivati sono impiegati nell’industria alimentare come agenti
naturali in grado di garantire la salubrità o per aumentare la durata della vita commerciale degli alimenti.
Gli antimicrobici ricavati dai vegetali sono ottenuti con varie tecniche da fiori, boccioli, semi, foglie, ramoscelli, corteccia, erbe, legno, frutti e radici delle  piante.
Alcuni degli estratti esercitano azione  antibatterica per gli olii essenziali particolarmente  presenti in
origano, aglio, cannella, cedro, coriandolo, prezzemolo, rosmarino, limone, salvia e vanillina (Tajkarimi  &coll. 2010).
Gli olii essenziali sono miscele di terpenoidi, sesquiterpeni, diterpeni insieme con idrocarburi aliftici, acidi,
alcoli, aldeidi, esteri aliciclici e lattoni (Fisher & coll.2006) .
Composti diversi, naturalmente presenti in natura o preparati per sintesi, dotati di attività antibatterica
sono l’acido laurico e i suoi due derivati monolaurina e argini nato laurico.
Si ritiene, ad esempio, che l’attività antimicrobica esercitata dal colostro umano sia mediata dall’idrolisi
dei trigliceridi ad opera della lipasi. Questo processo enzimatico libera acidi grassi(FA)e 1-monogliceri
(MG), i quali costituiscono la prima difesa dei neonati contro l’aggressione dei patogeni (Isaacs &coll.
2005).
Tra i componenti del colostro, gli acidi grassi a media catena (C-8 –C-14) ed i loro monogliceridi  sono 
attivi nei confronti di virus e streptococchi provenienti da bocca e naso di coloro che li accudiscono.
Oltre a ciò, è stato dimostrata la capacità di alcuni acidi grassi e dei loro monogliceridi di sopprimere
I geni responsabili dell’antibiotico resistenza e di provocare una frequenza di comparsa minore della
stessa nei batteri (Petshow & coll.1996; Ruzin & coll.!1998).
I composti citati non sono tossici ed è stato attuato il loro uso nel trattamento terapeutico di malattie
Infettive (Bergsson  & coll.2001,Nair & coll.2005;Rouse & coll.2005).
L’acido   laurico C-12) tra quelli a media catena esercita la più intensa attività antibatterica.
L’acido è presente  in alcuni alimenti come le noci di cocco,creme di cocco e  altri derivati in
concentrazioni elevate compreso  tra 11 e 37 g  della specialità e si trova anche nel latte materno in
quantità di 0,23 mg (USDA,1976,1982,1984,1998)
La monolaurina o  glicerolmonolaurato, glicerillaurato o 1_Lauroylac-glicerolo, é un monogliceride ottenuto dalla combinazione di glicerolo ed acido laurico. Il composto ha un effetto antibatterico pronunciato (Isaacs
& coll.2001;Preuss & coll.2005; Lieberman & coll. 2006;Carpo & coll.2007;Batovska
& coll.2009).
L’attivita antibatterica riscontrata dagli autori citati si è esercitata nei confronti di:
-Listeria monocytogenes
-Helycobacter pylori
-Haemophilus influenziate
-Staphylococcus aures
-Streptococcus agalactiae
-Streptococci gruppi A,B,F e G
-Bacillus antracis
-Mycobacterium terreum
In particolare lo studio di Batovska  & coll. (200)9,confermando  l’attività antibatterica di questo mono-
gliceride, ha dimostrato la sua maggiore efficacia rispetto a quella di altri monogliceridi come il  mono-
caprilico , il monocaprinico e il monomiristico .
La  monolaurina è stata utilizzata come conservante in prodotti a base di latte e nei cosmetici.
Un  terzo e nuovo composto  con acido laurico  è stato sintetizzato dai laboratori dai laboratori Miret
SA (LAMIESA,Spagna) ed   è  l’N’-L-arginina estere monoidrato   denominato LAE (Lauroilarginato estere) .
Le caratteristiche principali della molecola sono rappresentate da un’ ampia attività derivante dalla sua
struttura chimica di surfattant e alla sua tensioattività
Il prodotto è un   solido  igroscopico scioglibile in acqua fino alla concentrazione di 247 g/l con un punto
di fusione    compreso tra 50 e 58° C . Il suo coefficiente di partizione tra acqua e olio (soia,girasole,oliva)
è superiore a 10  ciò significa che  la molecola si localizza prevalentemente nella frazione acquosa, ove
si localizzano più facilmente i batteri (LIMA 2000).Tale proprietà avvantaggia LAE rispetto agli altri
conservanti non idrosolubili come  quelli prima citati.
LAE è stabile a pH compresi tra 3 e 7,mantenendo la sua attività antibatterica in questo intervallo.
Nel corpo umano LAE   è idrolizzato in composti naturali comunemente presenti negli alimenti consumati riuscendo innocuo consumatore.  La sua mancanza di tossicità  è stata documentata da molteplici  studi tossicologici (Ruckman & coll.2004 ,LMA031/004276;LMA050/04276.2000) cosicché il 1° settembre 2005 la FDA ha riconosciuto il composto come sostanza GRAS(Generalmente riconosciuta come innocua) permettendo il suo impiego come conservante in parecchie categorie di alimenti fino alla concentrazione ppm. di 200. Precedentemente l’USDA aveva concesso il suo impiego nelle carni, comprese quelle del pollame.

Proprietà antibatteriche in vitro

Nelle tabelle seguenti sono riportate le concentrazioni minime inibenti nei confronti di germi Gram pos
negativi,lieviti e muffe espresse in microgrammi/ml.(Manresa .2004)

Tabella n.1  MIC inibenti germi Gram positivi e Gram negativi.

Germi Gram positivi                                           mcg/ml       Germi Gram negativi                           mcg/ml

Alyciclobacillus acidiphilus  DSMZ 14558               8            Alcaligenes faecalis  ATCC 8750              14
Arthrobacter oxydans .    ATCC                                64          Bordetella bronchiseptica  ATCC 4817 126
Bacillus cereus var.mycoides ATCC  11778            32          Campylobacter jejuni ATCC  29428            8 
Bacillu s subtilis ATCC  6633                                     16          Campylobacter jejuni HC                            16
Clostridium botulinum  ATCC 19397                       64          Citrobacter freundii ATCC 22636              64        
Clostridium perfringens ATCC   77454                    16          Enterobacter aerogenes ATCC 13048       3
Clostridium perfringens ATCC 25601                      16          Enterobacter faecalis ATCC 27285              4
Lactobacillus  curvatus ATCC 25601                        16          Enterobacter sakazakii* ATCC 29544        32
Lactobacillus delbrueckii sp lactis  ATCC 10705     16          Escherichia coli 0157:H7 ATCC8739          32
Lactobacillus paracasei ATCC   25302                      16          Klebsiella pneumoniae  ATCC 4352           32
Lactobacillus plantarum ATCC 8014                         16          Proteus mirabilis   CECT 170                      32
Listeria monocytogenes   B4/97                                8            Pseudomonas aeruginosa ATCC                32
Listeria monocytogenes ATCC 15313                       32          Pseudomonas fluorescens ATCC13430    32
Leuconostoc  mesenteroi  des ATCC  19255             32        Salmonella cholerasuis  ATCC13076         8
Micrococcus luteus ATCC  9631                                128        Salmonella typhimurium ATCC 14928      32
Microbacterium phlei  ATCC 41423                          2            Shigella dysenteriae                                     8
Staphylococcus aureus ATCC 6538                           8            Serratia marcescens ATCC  10759             32
                                                                                                      Yersinia enterocolitica ATCC 27779           16
                                                                                                      Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802       128
*Ora Chronobacter.

 
Tabella n 2  MIC inibenti lieviti e  muffe

Lieviti                                                    mcg/ml                                   muffe                                         mcg/ml
Candida albicans ATCC 10231                 10                               Aspergillus niger  ATCC 14604              32
Rhodotorula rubra C4645ECT 1158                 16                      Aureobasidium pullulans ATCC9348    16
Saccharomyces cerevisiae ATCC9763      32                               Gliocadium  virens ATCC 6205               16
                                                                                                          Chaetonium globosum   ATCC 6205      16
                                                                                                           Penicillium chrysogenum ATCC 9480    128
                                                                                                           Penicillium  funiculosum CECT2914       16


Altri esperimenti sono stati eseguiti per valutare  la MIC  sporicide di LAE nei confronti di Geobacillus
stereothermophilus, Thermoanaerobacterium  thermosaccaharolyticum e Clostridium sporogenes.
L’attivita sporicida del composto è risultata di 216 mcg/ml per Geobacillus stearothermophilus, di
102 mcg/ml per Thermobacterium thermosaccharolyticum e di 51 mcg/ml per Clostridium sporoge-
nes (Università di Barcellona. Comunicazione personale).

 
Meccanismo di azione
Le  capacità antimicrobiche   di LAE sono dovute alla sua azione sulla membrane citoplasmatiche
che impedisce i processi metabolici ed il loro ciclo normale senza lisare la cellula microbica (Rodri-
guez & coll.2004). Per esempio, gli effetti di LAE sui batteri Gram negativi (Salmonella  typhimurium
ATCC 14028) e Gram positivi (Staphylococcus aureus ATCC 6538) sono stati esaminati trattando i
due microrganismi con le loro concentrazioni minime inibenti di 32 e 8 mcg/ml rispettivamente
riscontrando alterazioni delle membrane citoplasmatiche con conseguente  modificazione alterati-
va del potenziale  di membrana. Non si è registrata,inoltre,comparsa di resistenza (Rodriguez & coll.
2004)

Conclusione
LAE 8 commercialmente Miramat) è un prodotto antibatterico innocuo  rapidamente idrolizzato nei
suoi due componenti naturali nel tratto gastroenterico:
Numerosi studi tossicologici hanno confermato la sua innocuità: le prove hanno preso in considera zio-
ne  la sua metabolizzazione negli animali   e nell’essere umano,hanno valutato la mutagenicita,la
tossicità acuta,sub cronica e cronica,l’effetto sull’apparato riproduttivo  e lo sviluppo della tossicità
dopo trattamento (Ruckman & coll.2004).Tutti i protocolli sperimentali delle prove sono riportati nelle EFSA
Opinions  SCCP/0873/04,SCCP/1106/0708/ in Efsa  Journal 2012 (14,2652-2666)   e nell’Australian   full
Report STD 130).Attualmente il prodotto   in via di approvazione per essere inserito nella lista degli
additivi per alimenti della UE.
 Riassunto
Vengono descritte le attività antimicrobiche  e in particolare quelle di un nuovo  antibatterico
di  possibile impiego  negli alimenti il Lauorilarginato (LAE)

Summary
Antibacterial  activity of Lauric acid,Monolaurin and Lauoryl arginate
The  antimicrobial  activities of lauric acid,monolaurin  and laourylarginate have been  reported in
the text. The  new  antimicrobial compounds Lauroyl arginate have been outlined in detail.
 Bibliografia
Batovska D.;Todorova I.T;Tsvetkova I.V. & Najdensky H.M. (2009) Polish J:Microbiol.58,43-47.
Bergssson G.;Arafinnsson  O.;Steingrimsson  & Thormar  H.(2001)Antimicrob.Agents Chemother.
45,3209-3212.
Carpo B.G.;Verallo-Rowell V.M.& Kebara J.(2007) J.Drugs Dermatol.6,991-996,
Department  of Agricultural Handbook ns.8-1(1976);8-8 (1984;8-19 (1991).
Fisher K.& Phillips C.(2006) J.Appl.Microbiol. 101,1232-1240.
Isaacs C.E.;Litov R.&Thormar H.(1995) J:Nutri.Biochem.6,362-366.
Lieberman S.;Enig  M.G. & Preuss M.D.(2006) Alter.Compl.Ther. 12,310-314.
LIMA(2000)031/004276 Hundington life sciences,UK. Ford L.(1996) Antimicrob.Agents
Chemoth. 40,302-306.
Preuss H.; Echard D.Eng M & coll.(2005) Mol.Cell.Biochem. 272,29,34.
Rodriguez E.; eguer J.; Rocabayera  X. &Monsera A.(2004) j.Appl.Microbiol. 96,903-912.
Ruckman S.; Rocabayera X.; Segret R.: & coll.(2004)Food  Chem.Toxicol. 42,245-259.
Ruzin A. &coll.(1998) J.Bacteriol.180,182-185.
Tajkarimi M.M.; Ibrahim  S.A. & Oliver D.O.(2010) Food Control. 21,1199-1218.