Alcune caratteristiche di batteri termofili isolati da alimenti con bassa acidità in scatola.

Carlo Cantoni libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale, Milano.

Stefano Ibba Medico Veterinario, Milano

I  batteri  sono  stati  classificati  in base alle temperature che consentono una  loro rapida  crescita In  base a ciò  sono stati decritti    cinque   gruppi  maggiori: psicrofili, psicrotrofi, mesofili e ipertermofili .Per definizione, i termofili   hanno la loro  temperatura  ottimale  di crescita tra 50  e 80° C.I microrganismi  termofili sono stati ulteriormente  suddivisi  in  termofili  obbligati che crescono a 55°C  ma non a 37°C e  in  termofili  facoltativi  che  che crescono sia a 55 °C e  a 37°C.

Batteri  termofili in alimenti inscatolati

I prodotti alimentari a bassa acidità inscatolati  sono sottoposti  ad un trattamento termico  tale da  garantire la loro  stabilità commerciale durante la loro vita commerciale  per un lungo periodo  di conservazione .Per assicurare la loro stabilità biologica sono sottoposti a trattamenti  termici superiori a 100°C in ogni parte della confezione. Questi trattamenti garantiscono  l‘inattivazione delle forme vegetative e la parziale o totale inattivazione delle loro spore. (Codex   alimentarius. 1979; CTCPA, 2013). Oltre a ciò campioni dei prodotti  trattati termicamente  sono sottoposti a periodo di incubazione in termostato per evidenziare  la  eventuale germinazione delle  spore  sopravvissute. Le condizioni di incubazione sono di 10-14°C a  37°C (Codex alimentarius 1979) o  di  37°C per 7 giorni o a 32°C per 21 giorni (Standard francesi, Andrè & coll. 2013).Per  gli alimenti inscatolati  la temperatura di incubazione è di  55°C per tempi diverse  come indicato dalle linee guida dei paesi importatori. Tra i batteri btermofili non esistono specie o ceppi patogeni, ma loro presenza e conseguente sviluppo possono alterare la qualità commerciale del  prodotto inscatolato  o dimostrare una cattiva igiene di lavorazione. Come affermano Andre & coll. (2013) esistono pochi  studi sulla ricerca di termofili negli alimenti inscatolati e, quelli pubblicati, di solito si limitano ad un solo tipo di prodotto o alla individuazione di  un  genere di microrganismi termofili . Per  tale assenza di informazioni Andre & coll. (2013) hanno pubblicato un esauriente lavoro sulla presenza di termofili  riportando  generi e specie isolate e identificate  durante10 anni di indagini (Andre & coll.2013).Altri dati  sulla  presenza di termofili  in alimenti inscatolati sono stati riportati da Pironi & coll. (2005), da  Dolzauer & coll. (2012) nel  latte e  altre segnalazioni ,ottenute  con   la ricerca  di Thermobacterium   e Thermoanaerobacter  in alimenti inscatolati sono state pubblicate  da Burgess & coll. (.2010). I bacilli termofili sono dei potenziali contaminanti in vari tipi di industrie  quali: inscatolatrici, industria della carta, produzione succhi di frutta, raffinerie dello zucchero, industria dei derivati del pomodoro, produzione di gelatine e di prodotti lattiero caseari.

Generi e specie batteriche termofile  isolate da alimenti a bassa acidità

In base ai risultati  segnalati dagli autori citati i generi isolati da alimenti inscatolati sono stati: Anoxybacillus, Caldanaerobius, Gelria, Geobacillus, Moorella, Thermoanaerobobacter, Thermoanaerobacterium. Secondo Andre & coll .(2013) tre generi batterici sono stati responsabili di  alterazione di alimenti  in scatola: Moorella (isolate  nel 36 % di casi), Geobacillus (35%) eThermoanaerobacterium (10%), mentre  la presenza dei generi  restanti  si è constatata inferiore. Le percentuali riportate si riferiscono a 455 campioni di alimenti inscatolati a bassa acidità.

Le specie batteriche identificate hanno le seguenti caratteristiche e posizioni tassonomiche:

Anoxybacillus. Il genere Anoxybacillus fa parte della famiglia delle Bacillaceae, ordine Bacillalles, classe Bacilli phylum  Firmicutes. Del genere fanno parte 21 specie e 2  sottospecie. Le cellule batteriche  si presentano con forma di bastoncino diritto, talvolta appaiate o in catene con estremità arrotondate. Sono germi Gram positivi con spore  situate nelle parti subterminali o terminali della cellula. La maggior parte dei ceppi è anaerobio obbligata ,ma esistono anche ,nel genere, ceppi anaerobofacoltativi. I ceppi isolati sono A.flavitermus e A,contaminans e derivano da prodotti a base di latte

A.flavitermus è un batterio Gram positivo con spore terminali-Le sue colonie cresciute in terreni solidi si  presentano rotonde, liscie, di color giallo. Il germe è anarobio facoltativo, Catalasi e ossidasi positivo. Per la crescita  utilizza zuccheri. Positivo alle prove dell’acetoina, l’arginindiidrolasi, la lisindecarbossilasi, la triptofandeaminasi e la betagalattosidasi. Riduce i nitrati a nitriti. Il pH ottimale di il aerobiosi e  a 65°C in anaerobiosi..

A.contaminans. Le cellule sono curve o decisamente curvate, anaerobio facoltativo, catalasi positivo, ossidasi negativo. Ceppo debolmente mobile che si presenta singolo o in corta catena. Produce  endospore ovali in posizione sub terminale o sub terminale. Lo sporangio germina lentamente (Strot & coll.(2007).

Caldanaerobius spp. Nel genere sono presente tre specie : C .fijensis.C polysaccharolyticus, C zeae. Il genere è situato nell’ordine delle Thermobacteriales, classe Clostridia ,phylum Firmicutes. Le cellule  appaiono sole o appaiate con forma di bastoncino, anerobi e termofili, chemo-organotrofe. Producono formiato dalla fermentazione del glucosio. Gram positive ma alcuni ceppi sono Gram negativi. Formano spore terminali. L’intervallo  della temperatura  di crescita di C.fijensis è compreso tra  40 e 63°C .Non cresce a 38*C e sopra  71 °C. L’intervallo di pH per la crescita è di 4,5-8,4.Dalla fermentazione degli zuccheri produce etanolo. Riduce il tiosolfato a solfuro, con formazione di globuli di solfuro. Non riduce i nitrati, i nitriti, il solfato e il solfuro. E’catalasi positivo e non produce indolo.

C. polysaccarolyticus. La temperatura ottimale di crescita è di 65-68°C. La massima è di 70°C.Non cresce a  45°C e il pH ottimale è 6,5-7.0.

C.zeae. La temperatura massima di crescita  è di 72°C. Non cresce a 37°C il  pH è compreso  tra 3,9 e 7,9.Questi ceppi erano  denominati Thermoanaerobacterium spp..

Clostridium.  Per la difficoltà di distinzione di specie con i metodi biomolecolari Andre  & coll. (2013) hanno  segnalato la presenza di ceppi termofili, con la definizione di thermopalmarium/thermobutirycum ,alcuni ceppi  isolati da carni grasse di anatra in scatola. Con i metodi tradizionali sono nettamente distinguibili come risulta dalle descrizioni seguenti. La caratteristica comune a questi ceppi è la produzione di acido  butirrici con H₂,CO2,  e di altri composti minori. Entrambi i batteri appartengono al genere Clostridium, famiglia Clostridiaceae, ordine Clostridiales, classe Clostridi, phylum Firmicutes. C.thermobutirycum si presenta con cellule a forma di bastoncino diritto o lievemente incurvato, singole, o appaiate o  formanti un lungo cordone di 15 cellule. Nell’ultima fase  logaritmica della crescita e nella seguente fase stazionaria  si formano  cellule di grosse dimensioni  contenenti spore altrettanto di  notevoli dimensioni. La germinazione di queste si verifica in substrati  con pH di 6,2.çe spore sono centrali o sub terminali. Le cellule batteriche hanno flagelli peritriche ma sono poco mobili. SonoGram negative ma alcune possono presentarsi  Gram positive durante la crescita nella fase logaritmica. Sul terreno di coltura le colonie sono di color bianco crema, circolari, con margini con superfici irregolari. Il microrganismo è anaerobio obbligato. Il pH del substrato di crescita è compreso tra 5,8 e 9,0 con optimum tra  pH  6.8  e  7,1. Per la crescita del germe, nel terreno di coltura, è necessaria la presenza di estratto di lievito La temperatura ottimale di crescita è  di 50 -55 °C fino a 60 °C  .Il microrganismo fermenta il glucosio, il D-fruttosio, il maltosio, il D-xilosio e il D-ribosio   con produzione  di  acido butirrico, acetato, lattato, H_2.,CO₂ (Wiegel & coll.1991).

Clostridium thermoplantarium è un batterio anaerobio  obbligato. Le cellule vegetative  appaiono con aspetto di  bastoncini diritti L’organismo produce endospore  ellittiche  terminali o sub terminali che rigonfiano leggermente il corpo cellulare. Le cellule batteriche sono negative. Le cellule vecchie contengono  inclusioni simili ai granuli di beta-idossibutirrato. Hanno  flagelli  peritrichi ma sono poco mobili. L’acido butirrico è il prodotto principale  ottenuto dalla fermentazione di glucosio, xilosio  e  saccarosio insieme con piccole quantità di acetato ed etanolo oltre a H₂ e  CO₂.La temperatura ottimale di crescita è di 50-55 °C fino a 60°C. Il  pH del substrato di crescita è di 6,0-8,2 con optimum a  6,6. Lawson & coll.1991).

Gelria. Il genere Gelria fa parte  della famiglia delle Thermoananaerobacteriaceae. Ordine Thermoanaerobacteriales, classe Clostridia, phylum Firmicutes. Del genere fa parte una sola specie in : G.glutammica. E’ un germe  Gram positivo immobile; forma spore  terminali. E’ un germe immobile saccarolitico. Gli zuccheri sono convertiti  in  propinato,acetato,CO₂ e H₂.La crescita avviene tra37 e 60°C ,ottimale tra 50 e 60 °C, cresce a p di 6,5-8 (ottimale  pH 7) (Plugge & coll,2002).

Geobacillus. Il genere Geobacillus fa parte della famiglia delle Bacillaceae, ordine Bacillales, classe Bacilli, phylum Firmicutes. Comprende 28 specie e 4 sottospecie. Le specie isolate sono state identificate come:G.thermoglucosidasicus.G.stearothermophilis,G.calidoxylyticus.G.debilis.G.pallidus. Aluni ceppi non sono stati riconosciuti a livello di specie. Le caratteristiche comuni a tutte le specie e sottospecie sono le seguenti: cellule con forma di bastoncino , che si presentano singole o in corta catena e mobili per mezzo di flagelli peritrichi. Gram positivi.ma la colorazione varia  da Gram positività a Gram negatività. La   endospora, elipsoidale o cilindrica, è unica in ogni cellula e può situarsi terminalmente o subterminalmente  ed  è contenuta in uno sporangio rigonfio o non rigonfio a seconda dei casi. Nei terreni solidi di coltura  ha dimensioni variabili e in certi terreni può  presentarsi pigmentata. Sono batteri chemo-organotrofi, aerobici o facoltativamente anaerobici, obbligatoriamente termofili. L’intervallo di temperatura di crescita è compreso tra 37 e 75°C, con un optimum a 55- 65°C. La  crescita  avviene a pH  6,0 -8,5 con un optimum a pH  6,2-7.5. Come per altri termofili, le vitamine e l’estratto di lievito  sono fattori di crescita. I bacilli producono  acidi  ma non gas dagli  zuccheri (glucosio, fruttosio, maltosio, mannosio e saccarosio. Molte specie non producono acido dal lattosio. La maggior pare delle specie forma catalasi. Non deaminano a fenilalanina e la tirosina e non producono indolo, la reazione di Voges-Proskauer è negativa. Sono ossidasi positive o negative.

Moorella. Nei campioni  esaminati il  microrganismo più rappresentato  la specie Moorella, identificata come M.thermoacetica/M.thermoautotrofica, quindi di difficile identificazione con la PCR. Il  batterio appartiene al genere Moorella, famiglia delle Thermoanaerobacteriaceae, classe Clostridi , ordine  Firmicutes. Il genere Moorella comprende altre 5 specie.

M.thermoacetica. Le cellule vegetative  hanno forma di bastoncini che si presentano singoli, appaiati  o  in catena. Le cellule sono generalmente Gram positive ma  le cellule vecchie possono diventare Gram negative. Le  endospore sono rotonde o leggermente ovali e si trovano nella parte terminale o subterminale della cellula. M.thermoacetica è un batterio termofilo. La temperatura ottimale di crescita è di 50-60° C, quella massima è di 65-68°C. Il pH del terreno di crescita è di 5,7-7,68.Crescendo chemotrofomicamente produce  acetato,H₂ e e CO₂,mentre chemolitotroficamente produce metanolo ed acetato dalla fermentazione di zuccheri. (Collins & coll.1994).

M.thermoautotrophica. E’ simile al precedente(similitudine 99,3%). Si presenta con forma di bastocini   diritti  Gram positivi. La temperatura massima di crescita è di 60°C,la minima di 42°C.l’ottimale di 60°C. Il pH  di crescita del substrato è di.4,8-7,3.Produce acetato dagli zuccheri semplici.(Byer & coll.2000).

Thermoanaerobacter.Nel  genere  sono presenti 19 specie e 5 subspecie. Il genere Thermoanaerobacter fa parte della famiglia delle Thermoanaerobacteriaceae, ordine Thermoanaerobacteriales, classe Clostridia, phylum Firmicutes. Le specie isolate  sono  :Tr.thermohydrosulfuricus  Tr.mathranii/thermocopriae.

Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus. Il batterio ha forma di bastoncino. Le cellule si presentano sole o in corta catena, Le cellule di alcuni ceppi  appaiono con forma  di lunghi  gruppi filamentosi. Le cellule sono mobili e peritriche. Le spore sono sferiche  e terminali. Gli  sporangi gonfiano le cellule. Queste son Gram variabili. Il germe è anaerobio obbligato. La temperatura ottimale di crescita è di 67-69°C,la massima è di 76-78°Cresce  stentatamente  a  37°C.IlpH del substrato di crescita è di  5,5-9,2, ma la crescita ottimale avviene a pH 6,9-7,5.  Nei terreni di coltura a base di fegato il batterio produce H₂ e CO_2. H₂S  è prodotto  dal triptofano, peptone ed estratto  di  lievito. Il solfito e il tiosolfato sono ridotti a H₂S; il solfato non ridotto. I prodotti del metabolismo degli zuccheri  sono acetato, acidolattico, etanolo, CO₂ e  H_2-:Possono essere piccole quantità di acido formico,butirrico, isovalerico, isocaproi-co, propanolo ed isopropanolo. Il metanolo è il metabolita finale principale in presenza di pectina.(Lee & coll.1993).

Thermoanaerobacter mathranii. Anaerobio obbligato. Le cellule sono Gram variabili, mobili con flagelli peritrichi e con endospore terminali. I prodotti della fermentazione degli zuccheri sono etanolo,acetato,lattato,CO₂,H_2.La temperatura ottimale per la crescita né tra 70 e75°C,ma la crescita  avviene anche tra 55° e 75°C.Il pH  per la crescita è di 4,7-8,8 con un optimum a 7.0. Larsen & coll.1997).

Thermoanaerobacter  thermocopriae. Le cellule hanno forma di bastoncino diritto. Producono endopore terminali sferiche che rigonfiano la cellula Crescono a 55°-60°C.Sono Gram negative; sono anaerobie obbligate. La temperatura ottimale di crescita  è di 60°C, ma la crescita si  verifica a partire da 47°C  fino a 74°C.Il  pH del substrato di crescita è tra  6.0 e 8,0,ottimale tra 6,5-7,2.Ilmicrorganismo fermenta i carboidrati (specialmente il cellobiosio) dando luogo a CO₂,H₂etanolo,acido acetico, acido butirrico, e acido lattico. (Jin & coll.1988).

Thermoanaerobacterium. Il genere  fa parte della famiglia delle Thermonaerobacteriaceae, ordine Thermoanaerobacteriales, classe Clostridia, phylum Firmicutes. Del genere fanno parte 11 specie. Quelle isolate da prodotti in scatola sono state identificate come Tm.aciditolerans, Tm.aotearoense, Tm.saccharolyticum.

Tm.aciditolerans. Le cellule  sono  bastoncini diritti o  lievemente cusonorvi: le endspore sono ovali e sub terminali e non rigonfiano  la  cellula. Le cellule sono monotriche co flagello polare.  Gram positive. L’intervallo di temperatura di crescita è di 37-68°C e l’intervallo del PH del substrato di crescita è di 3,2-7,1.Il microrganismo fermenta un apio numero di carboidrati e di polisaccaridi. I  prodotti principali della fermentazione del glucosio sono acetato,etanolo,lattato,CO₂e H_2.Il germe è fortemente proteolitico. (Kublanov & coll.2007).

Tm.aotearoense. Il microrganismo ha forma di bastoncino con cellule Gram negative ma anche Gram positive, con flagelli peritrichi;le endospore sono terminali con forma ovale. E’ un termofilo acidofilo moderato  che  cresce tra 35 e 66°C ( la temperatura  ottimale è tra  60° e  63°C) e a pH 3,8-5,2. Converte il tiosolfato in zolfo elementare  depositandolo nel citoplasma cellulare. Produce acido da glucosio, lattosio, xilano, mannitolo e pectina. (Liu & coll.1996).

Tm.saccharolyticum. Le cellule del microrganismo sono bastoncini  diritti singoli, talvolta  appaiati, mobili. Gram positivi, Anaerobico, sono presenti flagelli. La temperatura ottimale di crescita è tra 65-68°. Quella massima di crescita è di 70°C.Non cresce al di sotto di 45°C.I l pH ottimale è  6,8-7.I prodotti terminali della fermentazione degli zuccheri  sono: etanolo, acetato, formiato e lattato. Utilizza per la  crescita glucosio, arabinosio, galattosio, lattosio, maltosio, mannosio, ramnosio, salicina, saccarosio , trealosio, xilosio, cellobiosio, raffinosio, melibiosio, melizitosio e piruvato

Thermoactynomyces. Altro microrganismo isolato casualmente da  alimenti in scatola. Il ceppo, non identificato a livello di specie fa parte del genere  Thermoactinomyces, famiglia Thermoactinomycetaceae, ordine Bacillales, classe Bacilli phylum Firmicutes. Nel genere sono presenti 1o specie. I thermoactinomyces sonobatteri Gram positivi crescono formando un micelio septato, ramificato. Formano  endospore nelle ife. Sono ceppi alcalofili che crescono bene in substrati con pH 7.Sono termofili, crescendo a  55-65°C.Producono serincellulasi, cellulasi,  ( Yoon &  coll.1999. 2000;Park & coll.2007).

Habitats dei termofili e conclusioni

Gli habitats naturali dei termofili sono rappresentate regioni caratterizzate da attività geotermiche (vulcani, fonti di acque termali. Foci idrotermali delle profondità marine sabbie di deserti) oltre ad essere presenti in materiali organici (immondizie, liquami, letami, compost, ammassi vegetali, pantani torbosi). Nell’industria di lavorazione della carne, nelle raffinerie dello zucchero, di lavorazione e inscatolamento di vegetali di produzione di gelatine, e  nelle industrie lattiero caseari e nei digestori per la produzione di biogas. I batteri termofili  sono stati isolati nel 1879 da Miquel , ma gli studi sono stati intensificati a partire dagli anni sessanta da  Brock (1970).Posseggono enzimi in grado di esercitare le loro funzioni ad elevate temperature: alcuni di questi enzimi sono impiegati in biologia molecolare come le DNA polimerasi termostabili per la PCR. La Taq è la DNA polimerasi termostabile utilizzata più comunemente  e deve il suo nome al Thermus acquaticus dal quale venne originariamente isolata.

Riassunto. Nel testo è riportata una breve rassegna sulle caratteristiche di batteri termofili recentemente  isolati da ricercatori in alimenti a bassa acidità in scatola.

Summary. Some characteristics of thermophilic bacteria  isolated from canned foods.

The following text is a brief  review on the characteristics  by  researchers which have been isolated from low acidity canned foods.

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