giovedì 29 maggio 2014

Considerazioni sul trattamento delle carcasse bovine e di pollame mediante l’uso di sostanze antibatteriche

Carlo Cantoni, libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale, Milano

Stefano Ibba, medico Veterinario, Milano

Per limitare  o per escludere la  presenza di germi patogeni nelle carni macellate, da tempo, in diversi paesi si è ricorso alla decontaminazione delle carcasse bovine e di pollame all’impiego di composti chimici. Ad esempio negli USA è permesso il trattamento delle stesse con antimicrobici approvati dalle autorità sanitarie (Food and Drug Administration e United States Department of Agriculture USDA) quali: il sodio clorito acido, il bromo, il diossido di cloro, il cetilpiridinio cloruro, alcuni acidi organici, l’ac.peracetico (PAA), il fosfato trisodico, il metasilicato di sodio, la monocloroammina, l’acqua elettrolizzata e l’acido ipocloroso (Mac Kee 2012).  Questi trattamenti  sono stati applicati in base ad un programma governativo avente lo scopo di ridurre il numero dei germi patogeni presenti sulla superfici delle carcasse e, quindi, delle carni derivate ed anche, contemporaneamente di limitare la presenza dei batteri deterioranti. La necessità di limitare i germi patogeni è dovuta alle modalità alimentari e culinarie in uso in quale nazione nella quale si rende necessario ridurre gli episodi di tossinfezioni alimentari dei quali sono ritenuti responsabili carni  cotte insufficientemente. Viceversa, in Europa, la refrigerazione è sempre stato il metodo principale per il controllo dei germi patogeni e dei deterioranti. Ora, in seguito alla emanazione del Reg.(UE)  n.101/2013, anche i macellatori europei possono trattare le carcasse bovine con acido lattico e,in  conseguenza dello stesso Regolamento, gli Stati Uniti possono aumentare la quota di esportazione delle loro carni non trattate con ormoni in Europa.  
Germi patogeni e deterioranti presenti su carcasse bovine e di pollame.

GERMI PATOGENI. L’importanza delle carni come fonte di patogeni dipende dal grado di contaminazione alla macellazione, da quello delle successive fasi di lavorazione (sezionamento e porzionamento) dalla possibilità di loro moltiplicazione durante la conservazione e, soprattutto, dall’osservazione di norme igieniche (HACCP) e di operazione eseguite secondo le cosiddette GMP, o pratiche di buona lavorazione. E’ doveroso sottolineare che le tossinfezioni conseguenti al consumo di carni è dovuto alla loro cottura insufficiente. Per inattivare i germi patogeni e di quelli necessario è sufficiente riscaldare le carni (a cuore) alle seguenti temperature; A) Carni di pollo e tacchino73°C; B) Carni trite, salsicce  68,3°; C) Bistecche, pesce. 62,8°C; D) Riscaldamento di alimenti carnei già cotti 73,9. I principali germi patogeni contaminanti sono: salmonelle spp; E.coli O157 H7, E.coli enteropatogeni, E.coli extraintestinali, Campylobacter. Nelle carcasse e nelle carni bovine possono talvolta trovarsi E.coli O157 H7 ed E.coli enteropatogeni mentre raramente lo sono altri patogeni. Nelle carcasse di pollo prevalgono le salmonelle spp. gli E.coli enteropatogeni. Gli E:coli patogeni extraintestinali e, soprattutto, le Campylobacter. L’E.coli O157:H7 è un microrganismo verocitotossico (VT) enteroemorragico (EHEC), i bovini e altri ruminanti sono portatori asintomatici ed eliminatori. I coli enteropatogeni sono raggruppati in 6 patotipi. I coli patogeni extraintestinali(ExpEC) causano infezioni extraintestinali nell’essere umano come infezioni del tratto urinario, setticemie, sepsi neonatali e meningiti e più raramente, polmoniti. La popolazione di questi E.coli è raggruppabile in 5 gruppi filogenetici A,B,B2, D. Principalmente i ceppi del gruppo B2, in numero minore al gruppo D e posseggono fattori di virulenza quali: adesine, lipopolisaccaridi, capsule, siderofori, proteasi, siero resistenza e producono tossine. I sierotipi responsabili di infezioni umane presenti nelle carni di pollo (denominati APEC=avian pathogenic E.coli) appartengono ad uno stesso sierotipo (O2:K1;O 18 :K1:O:78)  rappresentando quindi un rischio potenziale per il consumatore.
Le salmonelle nelle carne di bovino sono raramente presenti (S.dublin) mentre  possono spesso  localizzarsi nelle carni di pollo. In queste sono stati solati vari sierotipi: S. typhimurium, S. typhimurium monofasica, S .dublin, S. rinsen, S. Saint Paul. Da queste carni è frequente l’isolamento di ceppi del genere Campylobacter. Nel corpo umano i Campylobacter causano, dopo pochi giorni dall’infezione, febbre, mal di ventre e diarrea. In genere l’infezione non è pericolosa  ma negli ultimi tempi il numero dei casi in Europa è aumentato. I microrganismi si localizzano nel tratto intestinale di polli sani ed è diffuso in tutto il mondo. Al momento della macellazione degli animali non sempre si può evitare la contaminazione della carne. I Campylobacter si riscontrano nella carne cruda o insufficientemente cotta  di pollame. Per provocare l’infezione si ritiene siano sufficienti l’assunzione di 500 patogeni. Tra le malattie gastroenteriche di origine batterica degli umani la Campylobacteriosi è la più frequente. Nella maggior parte dei casi (90%) i Campylobacter sono batteri spiraliformi  che si muovono con un flagello. Si moltiplicano nell’intestino e vengono eliminati con le feci. L’ambiente ottimale per la loro crescita è a temperature intorno ai 42°C: con temperature superiori a 60°C muoiono. Il congelamento danneggia le cellule e riduce il numero di questi patogeni.

GERMI ALTERANTI. La popolazione batterica deteriorante è composta da germi psicrotrofi principalmente del genere Pseudomonas. Sono anche presenti Acinetobacter e Psycrobacter. Altri batteri,come ad esempio Brochotrix thermosphacta, si trovano in numero limitato e solo occasionalmente costituiscono una parte significativa della popolazione batterica alterante.
Impiego di acidi organici per la decontaminazione batterica delle carcasse di bovino e pollo.
Soluzioni di acidi organici (1-5%) come ac. Lattico, acido  acetico sono state quelle iù usate nei macelli statunitensi, australiani e nuovo zelandesi per la decontaminazione di carcasse (mezzene) bovine ed ovine. Diversi sperimentatori hanno constatato l’effettiva diminuzione di E.coli e di altri batteri contaminanti spruzzando acidi organici (lattico, acetico e proponico) direttamente su di esse o immergendole nelle loro soluzioni alle concentrazioni indicate prima (Ramirez & coll,1999; Ramson & coll.2003; Gill & coll.2003; Dubal & coll. 2004).
Si pensa che l’azione antibatterica sia dovuta alla penetrazione nella cellula batterica dell’acido indissociato il quale, abbassando il pH, attiva nei microrganismi dei processi di regolazione che consumano molta energia indebolendo la cellula. Gli acidi, inoltre, inibiscono l’attività di determinati sistemi enzimatici, come, per esempio, quelli necessari alla replicazione del DNA. Ciò fa sì che il microrganismo non possa più riprodursi. Il terzo effetto sarebbe dovuto alle molecole  degli acidi presenti all’esterno della cellula batterica che danneggiando la struttura proteica della membrana compromettono la permeabilità a sostanze minerali come sodio e potassio. La conseguente modifica della pressione osmotica della cellula, infine, determinerebbe infine la necrosi della cellula. Vi sono prove evidenti che il trattamento con acidi organici aumenti la vita commerciale delle carni confezionate sottovuoto o in atmosfera modificata allungando la  durata della lag fase dei batteri (Podololak & coll.1996).
Requisiti principali del Reg, UE n101/2013 relativo all’impiego di acido lattico per ridurre la contaminazione superficiale delle carcasse di bovino.
In base a quanto stabilito nel Regolamento le condizioni di impiego dell’acido lattico  sono:
1) Le soluzioni di acido lattico devono essere preparate a partire da acido lattico conforme alle specifiche stabilite dal Regolamento (UE)n.231/2012.
2) Le soluzioni di acido lattico devono: A) essere applicate solo su carcasse, mezzene o quarti di animali domestici della specie bovina (comprese le specie Bubalus e Bison) a livello del macello. B) essere applicate solo mediante spruzzatura o nebulizzazione utilizzando soluzioni   al 2-5% di acido lattico in acqua potabile a temperature fino a un massimo di 55°C. C) essere applicate in condizioni controllate e verificabili integrate in un sistema di gestione basato sul sistema HACCP che includa almeno i criteri di cui alla parte II. 
3) Le soluzioni di acido lattico non devono essere applicate alle carcasse con contaminazione fecale visibile.
4) L’applicazione di soluzioni di acido lattico non deve comportare modifiche fisiche irreversibili delle carni.
Parte II Criteri e parametri di controllo HACCP minimi.
1) Il campionamento delle carcasse, ai fini della valutazione del rispetto dei criteri microbiologici ai sensi del Reg.(CE)n.2073/2005, deve essere effettuato prima delle applicazioni delle soluzioni di acido lattico su carcasse, mezzene o quarti.
2) La concentrazione di acido lattico durante il trattamento, in quanto parte del piano HACCP, deve essere verificata mediante monitoraggio periodico, documentata e registrata.
3) La temperatura della soluzione di acido lattico durante il trattamento in quanto parte del piano HACCP deve essere monitorata costantemente con misurazioni strumentali, documentata e registrata.
Utilizzazione di acido peracetico su carcasse di pollame e  carne rossa.
Come ha eccellentemente precisato Ferri (2014), il Reg. (CE) 853/2004  per carni di pollame si devono intendere solo quelle idonee al consumo umano, che non hanno subito alcun trattamento diverso dal trattamento a freddo. Viceversa negli Stati Uniti è possibile trattare le carni di pollame con quattro antibatterici: biossido di cloro, cloruro di sodio acidificato, fosfato trisodico e per ossiacidi.
Queste sostanze vengono ritenute innocue da FDA e USDA. Considerato il notevole sviluppo del settore della produzione delle carni avicole negli Stati Uniti e delle enormi possibilità commerciali verso l’UE, il divieto europeo costituisce un serio ostacolo alle esportazioni negli scambi commerciali tra i due paesi(Ferri 2014) e, in base ai principi statunitensi, qualsiasi restrizione o limitazione allo scambio commerciale (importazione di prodotti e di animali) tra i paesi aderenti  ai cosidetti “negoziati di equivalenza” tra UE e USA non può essere impedita purché la salubrità dei prodotti oggetto di import/export sia assicurata scientificamente. Per  avere, quindi, la possibilità di esportare carni di pollame il Dipartimento dell’Agricoltura degli USA (USDA) ha presentato la documentazione richiedente l’impiego di soluzioni di acido perossiacetico destinate ad essere impiegate dagli operatori agro-alimentari. Nel corso della trasformazione, per la riduzione dei patogeni nelle carcasse e le carni avicole, in seguito alla richiesta della Commissione Europea, è stato richiesto all’EFSA di valutare la sicurezza e la efficacia di soluzioni di acido acetico destinate ad essere impiegate per soluzione  la riduzione dei patogeni sulle carcasse e carni avicole esaminando:
· La sicurezza tossicologica della sostanza.
· L’efficacia, cioè se l’impiego della sostanza riduce, in modo significativo, il livello di contaminazione dei patogeni sulle carcasse e carni avicole.
· La possibile comparsa di una riduzione di sensibilità ai biocidi e/o della resistenza agli antimicrobici terapeutici, legata all’uso della sostanza.
· Il rischio connesso all’impiego della sostanza nell’ambiente.
La sostanza, oggetto della sperimentazione è una soluzione acquosa contenente acido perossiacetico (PAA) come principio attivo. La soluzione, inoltre, contiene anche perossido d’idrogeno (acqua ossigenata) e acido 1-idrossietilidiene -1.1-difosfonico (HEDP) come stabilizzante del prodotto. In alcune miscele è aggiunto anche acido ottanoico con il ruolo di tensioattivo. Per la precisione,la richiesta richiede l’impiego del PAA su: 1)carcasse o parti delle stesse calde (preraffreddamento), 2) sulle carcasse in bagni di raffreddamento (raffreddamento). 3) su carcasse o parti delle stesse post raffreddate (post raffreddamento).
Il PAA può essere applicato anche come lavaggio mediante nebulizzazione o immersione, secondo la fase nella linea di lavorazione. La concentrazione del principio attivo utilizzata non deve superare 2.000 ppm nei bagni a breve termine, (3 minuti), e fino a 230 ppm nei bagni refrigeranti di lunga durata (esposizione durante il raffreddamento 1-2 ore)
La concentrazione nei lavaggi per irrorazione è tipicamente di 400-700ppm, per 10 secondi. La temperatura massima è quella ambientale ed il pH di una soluzione di 600 ppm è approssimativamente 2,5. Non è prevista una rimozione successiva delle soluzioni di PAA dalle carcasse e dalle carni avicole. Il PAA si dissocia molto rapidamente scindendosi in acido acetico ed acqua.
Il 6 marzo 2014 l’EFSA ha pubblicato il parere scientifico sull’argomento così  sintetizzato: 1) il trattamento con acido peracetico non conduce al rischio di tossicità legato a possibili prodotti di reazione del perossido d’idrogeno e  perossiossiacidi  con lipidi e proteine delle carcasse e carni di pollame. 2)è improbabile il rischio della comparsa di resistenza o di ridotta sensibilità ai biocidi e agli antibiotici. 3)non esistono rischi per la sicurezza dell’ambiente dovuta ai vari componenti della soluzione, fatta eccezione per HEDP, la cui fuoriuscita. 4) i alla nebulizzazione. 5) i piani di HACCP devono comprendere il monitoraggio della concentrazione di HEPD nella soluzione di lavoro  e la sorveglianza post-marketing per la resistenza antimicrobica ed antibiocida nei batteri patogeni e commensali. Questa opinione scientifica conferma quanto già si conosceva su questo modo di comunicazione descritto in dettaglio nei documenti  statunitensi ed è quindi solo una conferma dell’ovvio. Comunque costituisce la base scientifica per la eventuale adozione di un regolamento della Commissione come già avvenuto per le carni bovine.

Conclusioni

Dall’attenta consultazione del testo del Reg.101/2073 si evince che tale procedura non sarà verosimilmente mai adottata nel nostro paese perché le modalità di distribuzione della soluzione sanificante e la  serie di controlli batteriologici e chimici  la rendono economicamente improponibile. Il Regolamento è un espediente per permettere l’importazione delle carni dagli USA in Europa e  a nient’altro. La stessa affermazione vale nel caso di emanazione di un regolamento per la carne di pollame. Le precisazioni comportamentali ed i controlli analitici  presumibilmente imponibili in base a quanto riportato nel parere dell’EFSA eleveranno in modo insostenibile i costi della macellazione e distribuzione dei prodotti avicoli. Incredibile, inoltre la richiesta di verificare l’eventuale formazione di batteri resistenti ad antibiotici e biocidi. Proposta incredibile, da elencare tra i vari e numerosi euromiti. Fortunatamente nel nostro Paese, come in Europa. La  macellazione viene condotta con il corretto e sapiente impiego della refrigerazione e delle buone pratiche igieniche di lavorazione che forniscono carne igienicamente rispondente ai requisiti igienici. E’vero che le carni di pollo possono essere contaminate da batteri patogeni, ma  i rari episodi verificatisi sono stati provocati da umidi di carne di tacchino  consumati in mense, mantenuti a temperature superiori a 8° C e contenenti ceppi di Clostridium mentre non sono mai stati segnalati episodi causati da batteri patogeni non sporigeni.

Riassunto

Nel testo sono riportate  considerazioni sui trattamenti di decontaminazione delle carcasse e carni di bovino e di pollame ed è sottolineata la maggiore importanza dell’uso del freddo come garanzia della salubrità delle carcasse e delle carni derivate.
Summary On the bovine and poultry carcasses  organic acids.
In the text considerations have been reported on the bovine and poultry carcasses   and derived   meats with peroxydacid.The better  efficacy of cold treatment of these products has been outlined.

Bibliografia

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Mc Kee S. 2012 65th American Meat congr. 14
Podolak R.K.; Zayas J.F.; Kashner J.F. & fung D.Y.C. (1996) J FOOD PROT 59,1037-1040
Ramirez A. J.; Acuff J.; Lucia G.R. & Coll (2001) J FOOD PROT 64,1439-1441
Ramsom J.; Belk K.E.; Sofus E. & Coll (2003) FOOD PROT. TRENDS 23,24-34


lunedì 31 marzo 2014

Attività antibatterica di ac. laurico, monolaurina e lauroilarginato



Spezie, olii essenziali, acido laurico e suoi derivati sono impiegati nell’industria alimentare come agenti
naturali in grado di garantire la salubrità o per aumentare la durata della vita commerciale degli alimenti.
Gli antimicrobici ricavati dai vegetali sono ottenuti con varie tecniche da fiori, boccioli, semi, foglie, ramoscelli, corteccia, erbe, legno, frutti e radici delle  piante.
Alcuni degli estratti esercitano azione  antibatterica per gli olii essenziali particolarmente  presenti in
origano, aglio, cannella, cedro, coriandolo, prezzemolo, rosmarino, limone, salvia e vanillina (Tajkarimi  &coll. 2010).
Gli olii essenziali sono miscele di terpenoidi, sesquiterpeni, diterpeni insieme con idrocarburi aliftici, acidi,
alcoli, aldeidi, esteri aliciclici e lattoni (Fisher & coll.2006) .
Composti diversi, naturalmente presenti in natura o preparati per sintesi, dotati di attività antibatterica
sono l’acido laurico e i suoi due derivati monolaurina e argini nato laurico.
Si ritiene, ad esempio, che l’attività antimicrobica esercitata dal colostro umano sia mediata dall’idrolisi
dei trigliceridi ad opera della lipasi. Questo processo enzimatico libera acidi grassi(FA)e 1-monogliceri
(MG), i quali costituiscono la prima difesa dei neonati contro l’aggressione dei patogeni (Isaacs &coll.
2005).
Tra i componenti del colostro, gli acidi grassi a media catena (C-8 –C-14) ed i loro monogliceridi  sono 
attivi nei confronti di virus e streptococchi provenienti da bocca e naso di coloro che li accudiscono.
Oltre a ciò, è stato dimostrata la capacità di alcuni acidi grassi e dei loro monogliceridi di sopprimere
I geni responsabili dell’antibiotico resistenza e di provocare una frequenza di comparsa minore della
stessa nei batteri (Petshow & coll.1996; Ruzin & coll.!1998).
I composti citati non sono tossici ed è stato attuato il loro uso nel trattamento terapeutico di malattie
Infettive (Bergsson  & coll.2001,Nair & coll.2005;Rouse & coll.2005).
L’acido   laurico C-12) tra quelli a media catena esercita la più intensa attività antibatterica.
L’acido è presente  in alcuni alimenti come le noci di cocco,creme di cocco e  altri derivati in
concentrazioni elevate compreso  tra 11 e 37 g  della specialità e si trova anche nel latte materno in
quantità di 0,23 mg (USDA,1976,1982,1984,1998)
La monolaurina o  glicerolmonolaurato, glicerillaurato o 1_Lauroylac-glicerolo, é un monogliceride ottenuto dalla combinazione di glicerolo ed acido laurico. Il composto ha un effetto antibatterico pronunciato (Isaacs
& coll.2001;Preuss & coll.2005; Lieberman & coll. 2006;Carpo & coll.2007;Batovska
& coll.2009).
L’attivita antibatterica riscontrata dagli autori citati si è esercitata nei confronti di:
-Listeria monocytogenes
-Helycobacter pylori
-Haemophilus influenziate
-Staphylococcus aures
-Streptococcus agalactiae
-Streptococci gruppi A,B,F e G
-Bacillus antracis
-Mycobacterium terreum
In particolare lo studio di Batovska  & coll. (200)9,confermando  l’attività antibatterica di questo mono-
gliceride, ha dimostrato la sua maggiore efficacia rispetto a quella di altri monogliceridi come il  mono-
caprilico , il monocaprinico e il monomiristico .
La  monolaurina è stata utilizzata come conservante in prodotti a base di latte e nei cosmetici.
Un  terzo e nuovo composto  con acido laurico  è stato sintetizzato dai laboratori dai laboratori Miret
SA (LAMIESA,Spagna) ed   è  l’N’-L-arginina estere monoidrato   denominato LAE (Lauroilarginato estere) .
Le caratteristiche principali della molecola sono rappresentate da un’ ampia attività derivante dalla sua
struttura chimica di surfattant e alla sua tensioattività
Il prodotto è un   solido  igroscopico scioglibile in acqua fino alla concentrazione di 247 g/l con un punto
di fusione    compreso tra 50 e 58° C . Il suo coefficiente di partizione tra acqua e olio (soia,girasole,oliva)
è superiore a 10  ciò significa che  la molecola si localizza prevalentemente nella frazione acquosa, ove
si localizzano più facilmente i batteri (LIMA 2000).Tale proprietà avvantaggia LAE rispetto agli altri
conservanti non idrosolubili come  quelli prima citati.
LAE è stabile a pH compresi tra 3 e 7,mantenendo la sua attività antibatterica in questo intervallo.
Nel corpo umano LAE   è idrolizzato in composti naturali comunemente presenti negli alimenti consumati riuscendo innocuo consumatore.  La sua mancanza di tossicità  è stata documentata da molteplici  studi tossicologici (Ruckman & coll.2004 ,LMA031/004276;LMA050/04276.2000) cosicché il 1° settembre 2005 la FDA ha riconosciuto il composto come sostanza GRAS(Generalmente riconosciuta come innocua) permettendo il suo impiego come conservante in parecchie categorie di alimenti fino alla concentrazione ppm. di 200. Precedentemente l’USDA aveva concesso il suo impiego nelle carni, comprese quelle del pollame.

Proprietà antibatteriche in vitro

Nelle tabelle seguenti sono riportate le concentrazioni minime inibenti nei confronti di germi Gram pos
negativi,lieviti e muffe espresse in microgrammi/ml.(Manresa .2004)

Tabella n.1  MIC inibenti germi Gram positivi e Gram negativi.

Germi Gram positivi                                           mcg/ml       Germi Gram negativi                           mcg/ml

Alyciclobacillus acidiphilus  DSMZ 14558               8            Alcaligenes faecalis  ATCC 8750              14
Arthrobacter oxydans .    ATCC                                64          Bordetella bronchiseptica  ATCC 4817 126
Bacillus cereus var.mycoides ATCC  11778            32          Campylobacter jejuni ATCC  29428            8 
Bacillu s subtilis ATCC  6633                                     16          Campylobacter jejuni HC                            16
Clostridium botulinum  ATCC 19397                       64          Citrobacter freundii ATCC 22636              64        
Clostridium perfringens ATCC   77454                    16          Enterobacter aerogenes ATCC 13048       3
Clostridium perfringens ATCC 25601                      16          Enterobacter faecalis ATCC 27285              4
Lactobacillus  curvatus ATCC 25601                        16          Enterobacter sakazakii* ATCC 29544        32
Lactobacillus delbrueckii sp lactis  ATCC 10705     16          Escherichia coli 0157:H7 ATCC8739          32
Lactobacillus paracasei ATCC   25302                      16          Klebsiella pneumoniae  ATCC 4352           32
Lactobacillus plantarum ATCC 8014                         16          Proteus mirabilis   CECT 170                      32
Listeria monocytogenes   B4/97                                8            Pseudomonas aeruginosa ATCC                32
Listeria monocytogenes ATCC 15313                       32          Pseudomonas fluorescens ATCC13430    32
Leuconostoc  mesenteroi  des ATCC  19255             32        Salmonella cholerasuis  ATCC13076         8
Micrococcus luteus ATCC  9631                                128        Salmonella typhimurium ATCC 14928      32
Microbacterium phlei  ATCC 41423                          2            Shigella dysenteriae                                     8
Staphylococcus aureus ATCC 6538                           8            Serratia marcescens ATCC  10759             32
                                                                                                      Yersinia enterocolitica ATCC 27779           16
                                                                                                      Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802       128
*Ora Chronobacter.

 
Tabella n 2  MIC inibenti lieviti e  muffe

Lieviti                                                    mcg/ml                                   muffe                                         mcg/ml
Candida albicans ATCC 10231                 10                               Aspergillus niger  ATCC 14604              32
Rhodotorula rubra C4645ECT 1158                 16                      Aureobasidium pullulans ATCC9348    16
Saccharomyces cerevisiae ATCC9763      32                               Gliocadium  virens ATCC 6205               16
                                                                                                          Chaetonium globosum   ATCC 6205      16
                                                                                                           Penicillium chrysogenum ATCC 9480    128
                                                                                                           Penicillium  funiculosum CECT2914       16


Altri esperimenti sono stati eseguiti per valutare  la MIC  sporicide di LAE nei confronti di Geobacillus
stereothermophilus, Thermoanaerobacterium  thermosaccaharolyticum e Clostridium sporogenes.
L’attivita sporicida del composto è risultata di 216 mcg/ml per Geobacillus stearothermophilus, di
102 mcg/ml per Thermobacterium thermosaccharolyticum e di 51 mcg/ml per Clostridium sporoge-
nes (Università di Barcellona. Comunicazione personale).

 
Meccanismo di azione
Le  capacità antimicrobiche   di LAE sono dovute alla sua azione sulla membrane citoplasmatiche
che impedisce i processi metabolici ed il loro ciclo normale senza lisare la cellula microbica (Rodri-
guez & coll.2004). Per esempio, gli effetti di LAE sui batteri Gram negativi (Salmonella  typhimurium
ATCC 14028) e Gram positivi (Staphylococcus aureus ATCC 6538) sono stati esaminati trattando i
due microrganismi con le loro concentrazioni minime inibenti di 32 e 8 mcg/ml rispettivamente
riscontrando alterazioni delle membrane citoplasmatiche con conseguente  modificazione alterati-
va del potenziale  di membrana. Non si è registrata,inoltre,comparsa di resistenza (Rodriguez & coll.
2004)

Conclusione
LAE 8 commercialmente Miramat) è un prodotto antibatterico innocuo  rapidamente idrolizzato nei
suoi due componenti naturali nel tratto gastroenterico:
Numerosi studi tossicologici hanno confermato la sua innocuità: le prove hanno preso in considera zio-
ne  la sua metabolizzazione negli animali   e nell’essere umano,hanno valutato la mutagenicita,la
tossicità acuta,sub cronica e cronica,l’effetto sull’apparato riproduttivo  e lo sviluppo della tossicità
dopo trattamento (Ruckman & coll.2004).Tutti i protocolli sperimentali delle prove sono riportati nelle EFSA
Opinions  SCCP/0873/04,SCCP/1106/0708/ in Efsa  Journal 2012 (14,2652-2666)   e nell’Australian   full
Report STD 130).Attualmente il prodotto   in via di approvazione per essere inserito nella lista degli
additivi per alimenti della UE.
 Riassunto
Vengono descritte le attività antimicrobiche  e in particolare quelle di un nuovo  antibatterico
di  possibile impiego  negli alimenti il Lauorilarginato (LAE)

Summary
Antibacterial  activity of Lauric acid,Monolaurin and Lauoryl arginate
The  antimicrobial  activities of lauric acid,monolaurin  and laourylarginate have been  reported in
the text. The  new  antimicrobial compounds Lauroyl arginate have been outlined in detail.
 Bibliografia
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mercoledì 19 marzo 2014

Clostridi psicrotolleranti e rigonfiamento di confezioni di carni refrigerate sottovuoto in imballaggi plastici



Carlo Cantoni. Libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale. Milano

Recentemente i sono registrati nuovi episodi di rigonfiamento di carni sottovuoto refrigerate come già avvenuto in anni precedenti. Si è quindi ritenuto utile fornire  informazioni su questa alterazione fornendo anche le più recenti  conoscenze ottenute dai ricercatori su questo argomento. Storicamente il rigonfiamento delle confezioni  contenenti carni refrigerate mantenute sottovuoto causata da clostridi psicrotolleranti  si manifestata per la prima volta nel 1989. Due gruppi di ricercatori,lavorando il primo negli Stati Uniti (Kalchayanand & coll.1989) e il secondo nel Regno Unito (Dainty & coll.1989) identificarono un Clostridium sp quale responsabile dell’alterazione. Le confezioni apparivano gonfie per la formazione di un gas “di odore disgustoso  con presenza contemporanea di liquido liberatosi dal tessuto muscolare”.la carne presentava un colore smorto e poca consistenza (Kalchayanand.1989).In tempi successivi fu identificato il microrganismo responsabile e venne denominato Clostridium estherteticum da Collins & coll nel 1992. I clostridi pscrofili e psicrotrofi (psicrotolleranti) sono stretti aerobi ed stato chiarito che il rigonfiamento è dovuto alla contaminazione della carne con endospore resistenti. Queste contaminano gli ambienti di lavorazione della carne provenendo dalle pelli e degli animali da macellare e  vengono,poi,trasferite alle carcasse durante le operazioni di disossamento. Il miglior metodo per controllare il rigonfiamento da clostridi psicrotolleranti  basato sull’applicazione delle più rigorose  modalità igieniche possibili.Infatti le spore sono molto resistenti al calore, alle radiazioni UV e ai disinfettanti.

Caratteristiche dell’alterazione
I clostridi responsabili del rigonfiamento maleodorante delle confezioni delle carni refrigerate identificati sono stati identificati come C.estherteticum, C.laramiense, C.gasigenes e C.frigidicarnis. Ultimamente Moschonas & coll., (2011,2013) hanno isolato un nuovo clostridio da pelle  di bovino, potenziale causa di rigonfiamento. Il ceppo, denominato TC1 provvisoriamente, è sottoposto ad analisi fenotipiche, chemotassonomiche e genotipiche, è risultato una nuova specie. Inoculato in campione di carne confezionata sottovuoto  ha provocato il  rigonfiamento (bombaggio) dell’alterazione dopo 42 giorni di incubazione. E’ un nuovo clostridio di  considerevole importanza economica per l’industria della carne bovina. Altri clostridi psicrotolleranti non produttori di gas ma anch’essi agenti di alterazione delle carni sono stati identificati,precisamente: C.algidicarnis, C.algidixylanolyticum. Tassonomincamente, l’inclusione di un microrganismo nel genere Clostridium è basata su quattro caratteristiche morfologiche: la capacità di formare endospore, un metabolismo strettamente anaerobico l’incapacità di ridurre il solfato e la Gram positività della cellula. Tra i numerosi ceppi di clostridi è presente un’ampia diversità. L’analisi del 16S rDNA ha rivelato l’esistenza di 19 o 20 clusters (gruppi) tra i clostridi. Le  specie alteranti i prodotti carnei refrigerati confezionati sottovuoto sono tutti psicrofili o psicrotrofi e fanno parte dei gruppi 1 e XIV, tranne il clostridio TC1 Che non rientra nei due gruppi (Broda &coll.2002: Moschonas & coll.2013). In questa relazione si adottano le seguenti definizioni: PSICROFILI, temperatura ottimale di crescita 15°C o meno; temperatura massima di crescita da15 a 20°C; temperatura minima di crescita da -5 a 5°C. PSICROTROFI: temperatura ottimale di crescita tra 25 °C e 30°C; temperatura massima di crescita tra 30°C e 35°C; temperatura minima di crescita da 4°C-5°C. PSICROTOLLERANTI:il termine comprende i ceppi capaci di svilupparsi alle temperature di refrigerazione a partire da -5°C.Quindi i ceppi di C.estherteticum (C.estherteticum subsp. esterteticum e C.esterteticum subsp laramiense) originariamente isolati da carni refrigerate sottovuoto sono veri psicrofili. Le due sub specie estherteticum e laramiense hanno una temperatura ottimale di crescita di 6-8°C e di 15°C rispettivamente (Collins 1992) Il gas prodotto dai due clostridi contiene idrogeno, anidride carbonica, butanolo e  ac. butanoico (butirrico) in elevate concentrazioni, esteri e composti solforati. Il secondo produttore di gas, il C.gasigenes è uno psicrotrofo con una temperatura ottimale di crescita tra 20 e 22° come C.algidicarnis, la cui temperatura ottimale di crescita è tra 25°C-30°C. Anche il quarto clostridio, il C.frigidicarnis si sviluppa a 30-38 °C rientrando anch’esso in questa categoria. Complessivamente i clostridi psicrotolleranti isolati da carni sono: C.algidicarnis, C.algidixilanolyticum, C.estherteticum, C.laramiense, C.frigidicarnis, C.gasigenes e Clostridium TC 1. Altri clostridi psicrotolleranti sono stati isolati da terreni, fanghi permafrost e da acque: C.algarophilum, C.bowmanii, C.lacusfryxellens e C.tagluense ( Spring & coll. 2003; Shcherbakova & coll. 2005; Sustin & coll.(2009).

Presenza di clostridi psicrotolleranti in carni refrigerate confezionate causa di rigonfiamenti (bombaggi)
I prodotti carnei presenti nelle confezioni rigonfie sono stati: tagli carnei di bovino, ovino, cervo, arrotolati carnei cotti per cani, tacchino precotto, roastbeef e vari prodotti carnei. Tutti alimenti contenuti in imballaggi di materiale plastico impermeabile all’ossigeno. Le confezioni rigonfie per presenza di C.estherteticum sono state riscontrate negli Stati Uniti, Nuova Zelanda, Irlanda, Sud Africa (Helps & coll.1999). C. estherteticun subsp lameriamiense è stato isolato nel Nord America (Kalchayanand & coll.1993). C.gasigenes è stato isolato in carni in Irlanda, Regno Unito e Nuova Zelanda (Cavill & coll.2011). C.frigidicarnis e C.algidixilanolyticus sono risultati responsabili di alterazione di carni confezionate sottovuoto  preparate in Nuova Zelanda (Yang & coll.2009). C.algidicarnis è stato isolato da carni suine cotte nel Nord Europa (Lawson & coll.1994) e da carni refrigerate in Nuova Zelanda  sopratutto cosce e lonze suine (Boerema & coll.2002). Le carni ovine sono risultate più contaminate rispetto a quelle bovine (Amin & coll. 2011). In Italia, nonostante i numerosi casi registrati non è stato possibile isolare i clostridi responsabili per errori  dovute alle tecniche d’indagini adottate.

Condizioni che permettono a crescita dei clostridi psicrotolleranti nelle carni confezionate sotto vuoto
Oltre a C.estherteticum e C.laramiense anche C.algoriphilum, C.bowmanii, C.frigoris, C. frigidicarnis, C.lacusfryxellense, C.psycrophilum, C.tagluense e C.vincenti sono in grado di crescere nel substrato carneo metabolizzando il glicogeno,il glucosio formatisi nel tessuto muscolare dopo la morte dell’animale. Quando il loro contenuto diminuisce quasi completamente, C. frigidicarnis utilizza per la crescita gli aminoacidi, mentre C.algidixylanolyticum e C.frigidicarnis utilizzano glicogeno, glucosio e lattato contemporaneamente durante la loro crescita e dopo  quando cessa. C.algoriphilum e C.frigoris cominciano ad utilizzare il lattato, utilizzando poi glicogeno e glucosio solo dopo il termine della loro fase di crescita, sebbene l’utilizzazione del lattato da parte di C. algoriphilum sia lieve. C.psychrophilum interrompe l’utilizzazione del glicogeno e del glucosio ma inizia una  lieve utilizzazione del lattato al termine della sua crescita. Le altre specie restanti C..esterthticum, C.bowmanii, C.gasigenes, C.tagluense e C.vincentii non utilizzano più alcun substrato dopo il termine del loro sviluppo. L’utilizzazione del glicogeno, glucosio e di quantità relativamente elevate di lattato  cessata la loro moltiplicazione da parte di C.algidixylanoliticum, C.frigoris e  C.frigidicarnis indica che questi microrganismi sono una causa potenziale, anch’essi di rigonfiamento delle carni refrigerate confezionate (BPS =blown pack spoilage) mentre tutti i restanti clostridi psicrotolleranti conosciuti non svolgono alcun ruolo in proposito (Yang & Badoni 2013).

Attuali possibilità di prevenzione del rigonfiamento delle confezioni di carni refrigerate sottovuoto.
Ricerche eseguite in Irlanda e  Nuova Zelanda in mattatoi hanno constatato che la contaminazione dei locali di lavorazione della carne deriva dalle pelli degli animali e che i clostridi sono pure presenti nelle feci  degli animali. Da queste fonti i clostridi vengono  a contatto con le carcasse durante le fasi di macellazione e di disossamento delle carcasse .C.estherteticum e C. gasigenes sono stati isolati dal suolo, dalle pelli grezze e dalle feci, ma non nei locali di sezionamento  e solo in limitate concentrazioni sui pavimenti contaminati dai calle calzature del personale  (np) (Moschonas & coll.2009). Al momento la  principale strategia da adottare in proposito è  basata sull’ applicazione delle GMP ( Good Manufacturing Practice) durante le fasi di lavorazione, prestando cura particolare nella fase di scuoiamento, evitando il passaggio di personale da questa zona al resto dei locali di lavorazione. Per la sanificazione degli ambienti e superfici  si deve obbligatoriamente ricorrere all’uso di disinfettante a base di acido perossiacetico. Altre strategie di intervento che hanno fornito qualche risultato, comunque con conclusivo, sono state l’aspersione di acido lattico sulle superfici delle carcasse, il loro lavaggio con acqua calda o  il trattamento con vapore. Tuttavia questi due ultimi trattamenti potrebbero riuscire controproducenti perché potrebbero far germinare le spore.

Tecniche per l’isolamento e l’identificazione dei clostridi psicrotolleranti
Le modalità di isolamento e di identificazione dei clostridi psicrotolleranti con i metodi tradizionali di batteriologia sono operazioni complesse richiedenti molto tempo per consentire la crescita dei clostridi (da 14 a 38-40 giorni) con l’incubazione delle colonie in stretta anaerobiosi  a 10°C di temperatura. Per il loro isolamento è necessario adottare il metodo di Lund & coll. (1990) che prevede  la sospensione del campione o dell’essudato in brodo preridotto (riscaldandolo) in terreno PYGS brodo e strisciandolo su Columbia Blood agar (CPA)addizionato del 5% di sangue di cavallo o di sangue di pecora (Boerema & coll.2003,  Moschonas & coll.2013). I campioni in esame alternativamente, possono essere trattati con ertanolo per eliminare i contaminanti salvaguardando le spore I ceppi isolati devono essere insemenzati in Reinforced Clostridium medium in stretta anaerobiosi. Per la successiva identificazione dei ceppi cresciuti si deve ricorrere all’esame del 16SrRNA. Un  metodo più rapido, ma solamente indicativo prevede la determinazione dei composto volatili del gas mediante GC/massa I composti di riferimento per C.estertheticum sono l’ac. butanoico (acido butirrico), l’a.butanolo, il 2-metil-etil-estere dell’ac. butanoico e il 3 metil butanolo-3.metil butanale.Possono essere presenti in tracce etanolo, 1-esaolo.1.propanolo(alcoli) Benzaldeide, eptanale, esanale (aldeidi). Cicloottano, etilbenzene,xilene (idrocarburi).2-butanone,-3-butanone.propanone.acido acetico. Dimetil solfuro, dimetil disolfuro, di metil trisolfuro (composti solforati)

Tabella riassuntiva di alcune caratteristiche di clostridi psycrotolleranti

Ceppo
Fonte
Temperatura ottimale di crescita (°C)
Intervallo crescita
PH
Tipo di alterazione
C algidicarnis                 
Carne sottovuoto
25-30
4-37
-
Alterazione superficiale
C.algidixylanoliticum   
Carne sottovuoto ovino




C.estherteticum
subsp estherteticum         
Carne sottovuoto
6-8
1-15
6,5-7,2
Blown pack
C.estheteticum subsp. lameramiense                   
Carne bovina fresca
roastbeef
Idem
Ideam
Idem
idem
C.frigidicarnis                    
Carne bovina
30-38,5
3,8-40,5
6,4-7,2
Alterazione superficiale
C.gasigenes                            
Carne ovina refrigerata
20-22
-1,5 – 26
6,2-8,6
Blown pack

                                       
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