Extraintestinal E.coli in animali allevati ed alimenti di di origine animale

Carlo Cantoni,Libero docente  di Ispezione degli alimenti di origine animale.Milano

Stefano Ibba,medico veterinario.Milano

Le Escherichia coli sono bacilli gram negativi  molto versatili con la capacità di localizzarsi e colonizzare in diversi ambienti. Sebbene questi microrganismi si trovino prevalentemente nel tratto intestinale dell’essere umano ed animale possono anche venire isolati da diversi substrati ambientali. I ceppi di E.coli possono essere divisi in tre ampi  gruppi caratterizzati, in base alla loro virulenza e da loro tropismo, in commensali, patogeni  intestinali e patogeni extraintestinali. I ceppi commensali di E.coli costituiscono il gruppo principale della popolazione fecale facoltativa dell’essere umano sano,dei mammiferi e dei volatili. Nell’intestino degli ospiti questi batteri sono presenti  con rapporto simbiotico e sono innocui, tranne quando si verificano cadute drastiche del potere immunitario o nel caso di presenza di lesioni intestinali.

La maggior parte dei ceppi di E.coli commensalidell’intestino umano appartengono al gruppo  filogentetico e sono privi di geni e di isole di virulenza  che sono  presenti, invece, nei ceppi patogeni intestinali ed extra- intestinali.Contrariamente ai ceppi commensali , le E.coli patogene si trovano  di rado nella popolazione  batterica fecale degli ospiti sani e si rivelano tali,provocando gastroenteriti o coliti quando sono ingeriti in numero  sufficiente nell’ospite.Si  conoscono sei categorie ,o patotipi,di  E.coli patogene intestinali : gli enterotossigenici  (ETEC),i produttori di tossina Shiga enteroemorragici  (STEC/EHEC),gli enteropatogeni (EPEC),gli enteroinvasivi(ETEC),gli enteroaggreganti (EAEC) e i diffusamenti aderenti (DAEC).La Shigella (sebbene sia un microrganismo differente da E.coli) può essere considerata il settimo patotipo. (Russo &Coll.2000).

Con la determinazione del polimorfismo elettroforetico delle esterasi e di altri enzimi sono  stati individuati i seguenti gruppi di  Escherichia coli , A  , B1,B2,C,D, ed E. La patogenicità dei singoli ceppi è l’espressione di specifiche combinazioni di fattori di virulenza che possono venire acquisiti per trasferimento orizzontale (ad esempio: plasmidi o fagi lisogeni),da ceppi di linee  evolutive  distanti. Tranne la capacità di causare malattie enteriche, i patotipi citati  sono  incapaci di causare altre patologieal di fuori dal tratto intestinale ma esistono altri patotipi di E coli in grado di causare  patologie sistemiche extra intestinali denominati ExPEC.In questa sede  vengono trattati solo quelli riguardanti la spdecie umana.

E.coli extraintestinali

Le infezioni extraintestinali (EI) causate da E.coli extraintestinali sono comuni in soggetti di tutte le età e possono  manifestarsi a danno di tutti gli organi  e di altri siti anatomici. Le tipiche infezioni da E.coli com-prendono infezioni urinarie (UTImenin),giti neonatali o in seguito ad intervento chirurgico,diverse infezioni addominali,polmoniti (specialmente in pazienti ospedalizzati),infezioni vascolari, osteomilelitie Infezioni del muscolare, possono, inoltre,verificarsi setticemie-tessuto

I ceppi ExPC sono stati definiti da Johnson & coll.(2003) come E.coli contenenti 2 o più dei seguenti fattori di virulenza:papA P sub unità strutturale delle fimbrie) e/o papC (isieme di fimbrie),sta/fac (sub unita di fimbrie D e FIC),afa/dra(dr:antigene legante le adesine), KpsMT II (unità capsulare polisaccaridica del gruppo 2) e intA (recettore di aereobactina). Altri indicatori di virulenza sono riportati nella tabella I.

Tabella n .! Fattori addizionali di virulenza che possono essere presenti in  ExPEC

Genotipo di virulenza                     geni codificanti

·         pap  GIII                                           unità adenosiniche varianti P fimbriale

·         csg                                                     curli

·         fim                                                     adesina fimbriale tipo I

·         sfas                                               lectina fimbriale –acetil-glucosaminica

·         adesina regolante il ferro

·         fyuA                                             recettore di yetsiniobactina

·         ire Iha                                                A                                            recettore sideroforo

·         int A                                            recettore aereobactina

·         Kpts  MT II                                 subunita polisaccaridica capsulare  gruppo2

·         K1                                               K1 (gruppo 2)varianti kps

·         IbeA                                              invasine di endotelio cerebrale

·         TraT                                             resistenza al complemento sierico

·         iss                                               aumento  sopravvivenza nel siero

·         ampT                                          subunita della proteasi T  extramembrana

·         cvac                                           sub unità strutturale colicina V

·         mal X                                          isola  CFT073dipatogenicità

·         emolisina

·         Cnf 1                                         fattore di necrosi,citotossico

·         cdtB                                          tossina citoletale (proteina B)

·         da  Smith & coll,(2007)

Antibiotico resistenza di  ExPEC

La resistenza agli antibiotici  betalattamici (ESBL) è una caratteristica fondamentale dei ceppi di  E.coli responsabili di infezioni (Oteo & coll.2005;Pitout & coll.2005). Gli antibiotici betalattamici sono raggruppati In  sei gruppi con  le relative sottoclassi a seconda di come l’anello lattamico si legaal resto della molecola e secondo dell’originedella molecola  come riportato nella tabellan.2

Tabella n. 2 Classificazione degli antibiotici betalattamici

Classe                                             sottoclasse

Penicilline                                       Penicilline,Aminopenicilline,UreidopenicillineCarbossipenicilline.Penicillasi

                                                         Aminpenicilline

Cefemici                                         Cefalosporine di prima generazione,Cefalosporine di seconda generazione,

                                                          Cefalosporine di terza generazione,Cefalosporine di quarta generazione,

                                                            Cefamine,Oxacefemici,ceftriazone,cefixirina

Cefemici orali)                                  cefalosporine ,Carbapenemici

Monobattamici                                es, aztreonam
Penemici                                           Carbapenemici Penemici 

Beta lattamasi inibitori  

Identificazione dei ceppi di exPEC    

Oltre alla sierotipizzazione oggi si usa la tecnica MSLT (0 Multilocus sequence typing) che permette di individuare il gruppo originario (A,B1,B2,D) e la sequenza, per esempio O 25:H4-B2-SM 131 Menges  coll.2012  ). Usando queste tecniche si è constatata la presenza di ExpPEC in animali allevati ed in alimenti di origine animale e si è evidenziata la possibilità di trasmissione di tali ceppi all’essere umano tramite queste fonti .Nella tabella n .3 sono riportate  le evidenze della esistenza di fonti  alimentari e di vie di trasmissione di   ExPEC alla specie umana secondo Manges  coll. (2012)

Tabella n.3 esistenza antimicrobica ed animali portatori di ceppi ExPEC

Gruppi ExPEC umani	Resistenza antimicrobica	Produzione ESBL	Pollame/carne	Suini/carne	Bovini/carne
O25:H4-B2-  ST 131	+	+	+	+	+
O11/O17/O77:H 18-D-ST 69	+		+	+	+
O15:K 52:H1-D-S393	+
Sierotipo (vario )A-ST10	+	+	+	+
Sierotipo (vario)-D-117	+	+	+
O1/O2/O18:K1:H7-B2-ST95	+	+	+
O6:H1-B2-ST73	+	+
Sierotipo (vario)-D-ST405	+	+
O75:K+:H5-B2-ST 14	+

                

Nota:Moltei  E.coli ST 10 non sono ExPC,quelli Exp sono  antibitico resistenti.

  Il  sierotipo E.coli si à reso responsabile di infezioni UTI nell’essere numano ed è stato isolato da animali selvaggi ,animali da macello,da campioni di carne di pollo in Canada (Vincent,2010)da polli.e suiniin  Spagna Cortes coll.(2010).

E.coli è stata isolata dai suini e da casi di UTI in Danimarca e in Norvegia.

Il  sierotipo E.coli 011 /17/77;K52:H18-D.ST69  (denominato anche g o gruppo clonale A) è stato isolato in California e in altre parti del mondo quale causa riconosciuta di infezioni urinarie in diverse parti del mondo (Johnson & coll: 2006,Dias &coll 2009;Johnson 2011). Le fonti originarie del microrganismo sono il suino,il pollo e,probabilmente ,il bovino (Ramchandni &coll.2005;Vincent & coll.2010,Johnson 2011).In uno studio sperimentale eseguito somministrando topini da laboratorio ,ceppi CgA isolati da pazienti umani e da  carni di pollo  hanno  provocato infezioni UTI   negli animali contaminati dimostrandosi cosi che le carni di pollo contaminate da ceppi Cga possano essere causa di UTI anche nell’essere umano (Jacobsen & coll:2010).

Il complesso clonale del sierotipo E.coli (vario)-A-ST 10 (ST10 e i vari ST10 collegati),sebbene si siano dimostrati suscettibili agli antibiotici,colonizzatori intestinali umani e poco virulenti,sono stati pure  ritenuti causa di infezioni umane e produttori di ESBL.Questi ceppi sono stati isolati da casi clinici,da alimenti carnei (pollo,suino) e da mangimi per animali (Cortes & Coll.2010; Oteo Coll.2009; Cohen Stuart & Coll.2012).

Inoltre, in uno studio eseguito in Olanda,ceppi ST10 CTX-1 sono stati isolati da emocolture umane e nel pollame,mentre ceppi di ST 10 TEM-52 lo sono stato da urino colture umane e da pollame. Un altro studio,anch’esso eseguito in Olanda, ha consentito di isolare ed identificare E.coli ST10 produttori di ESBL presenti  in carni di pollo, in altri tipi di carne, campioni fecali di essere umani sani, e da emocolture umane Overdevest & coll.2011: Manges 2012).Ancora, in  Canada sono stati isolati ceppi ST 10 antibiotico resistentida campioni clinici mani,pollame,feci di suino,in carni porzionate di pollo (Racicot Bergeron & coll.2012).

Il sierotipo E.coli S117(vario)-D-ST117, appartenente alla linea APEC (ceppi di origine aviare,Mora & Coll.2011).è stato isolato da una setticemia umana e ceppi di ST 117 sono stati isolati da carni di pollo e nell’essere umano (Leverstein & coll.2011; Overderest & coll.2011)

Il sierotipo strettamente correlato E.coli O114:H4-ST117 è stato, a sua volta, trovato in un caso umano di UTI ed in porzioni di carne di pollo in Canada (Vincent & coll.2010).

E.coli O1/oìO2/O18:K1:H7-B2-ST 95,appartenente  al gruppo clonale APEC (Antao & Coll.2009), è un patogeno umano ritenuto responsabile del 6% delle infezioni extraibtestinali (Gibreel & Coll. 2012). Questo microrganismo è risultato presente negli umani e nei polli sani, in meloni e in infezioni umane (Mora & Coll.2009;Vincent & Coll.2010).

Altri  sierotipi di E.coli  (O1,O2, e O 18)sono stati isolati da diverse fonti animali(Johnson & coll.(2008)

I ceppi di E.coli O18-B2-ST 95,oltre a casi di meningiti neonatali hanno pure  provocato setticemie nei polli (Moulin-Schouler &Coll.2007) e, a loro volta, ceppi di E.Coli O18-B2-ST 95, isolati da casi di colibacillosi aviare (APEC) hanno provocato meningiti neonatali nel ratto (Twendale &Coll.2010).Tutto ciò indica che i ceppi APEC ST 95 si possono ritenere  agenti  causa di zoonosi.

Manges & Coll. (2012) fanno presente  che  sono conosciuti altri gruppi di ExPEC patogeni per  l’essere umano non associabili ad animali viventi o ad alimenti di origine animale e responsabili di infezioni extraintestinali,ad esempio E.coli o15:K52:H1-D-ST 93 causa di infezioni extraintestinali appunto. Questo microrganismo è strettamente correlato a O11/O17/O77:K52:H18-D-ST 69.Altre E .Coli sono  lo O6/H:1-B2-ST69 ,l’E.Coli O6/H1-B2-ST 73,l’E.coli sierotipo (vario).D-ST 405 e il sierotipo O75:K+:H5-B2-ST14. Tutti questi ceppi batterici sono antibiotico resistenti ed ESBL produttori.

I dati riportati,ottenuti con ricerche specifiche, dimostrando con sempre maggiore evidenza  la potenziale capacità di certi gruppi di ExPE  isolabili da animali e in carne derivate possono provocare infezioni  extraintestinali nell’essere umano. Infatti le somiglianze tra gli ExPEC umani e i ceppi di E.coli isolati da polli.tacchini.suini,  suggeriscono la possibilità di loro trasmissione diretta all ‘essere umano. Viceversa la

sicura trasmissione dei ceppi  ExPEC dagli alimenti all’uomo necessità di ulteriore conferme. E’ tuttavia possibile la contaminazione crociata da carcasse di pollo manipolate nelle cucine ad altri alimenti ivi preparati (Manges & Coll.2012). Un altro  fattore ignoto  è il numero di E.coli ExPEC causante l’infezione.

Determinazione batteriologica di ceppi ExPc

L’isolamento di ExPEC deve essere eseguita utilizzando terreni cromogeni che permettono di distinguerli in base alla  colorazione delle colonie cresciute dalle altre  Enterobatteriacee eventualmente presenti e da altri contaminanti quali Pseudomonas.Acinetobacter e Stenotrophomonas spp.

I terreni cromogeni selettivi utilizzabili sono:

-CromID ESBL (bioMerieux)

-Brilliance ESBL (Oxoid)

-CHRomagar ESBL  e CHROMagar CTX (CHROmagar)

Terreno cromogeno	antibiotico	enzima	E.coli	Klebsiella	Proteus
Cromid ESBL	cefpodoxima	beta -glucoronidasi	rosso/rosa
		beta- glucosidasi		verde/blu	bruno grigiastro
		triptofano deaminasi			Nero o     marrone
Brillance ESBL	cefpodoxima	beta-glucoronidasi +betagalattosidasi	blu
		beta-glucoronidasi	rosso
		beta galattosidasi		verde
		triptofano deaminasi			alone marrone
CHROMagar		non dichiarati	rosso scuro	blu	alone marrone

Caratteristiche delle colonie di batteri non fermentanti Gram – cresciute su terreni cromogeni

Terreno cromogeno	Pseudomonas	Acinetobacter	Stenotrophomonas
cromoID  ESBBL	assenza di colorazione	bianca	priva di colore
	rosata/brunastra per produzione di piocianina
Brilliance ESBL	prive di colore per  Produzione di pio cianina	priva di colore/ bianca	la maggior parte bianca
CHROMagar ESBL	verde/bruna o bianca	priva di colore o bianca

Riassunto

E.coli sono batteri versatili presentandosi come commensali, patogeni intestinali ed extraintestinali. Studi recenti hanno prospettato la possibilità di attività patogena di sierotipi ExPEC presenti e trasmessida animali ed alimenti di origine animali. Sono descritti i sierotipi ESBL produttori responsabili di infezioniextra intestinali.

Summary

ExPC E.coli,food animal and food trasmission to human.

E.coli bacteria are commensals, intestinal and extraintestinal pathogens. Animal food and animal food products contaminated have been considered of possible causes of extraintestinal infection for the presence of ESBL Coli. In the text the responsible serotypes have been described and the isolation media have been reported.

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Criteri microbiologici e conformità igienico sanitaria degli alimenti

Carlo Cantoni.Libero docente in Ispezione degli alimenti di origine animale.Milano

Stefano Ibba.Medico Veterinario Milano

La sanità e la conservabilità di un alimento sono requisiti principali della qualità dei prodotti alimentari.Per garantirle da danni biologici sono statimessi a punto con i Reg.CE 2073/2005  e Reg. CE 1441/2007 dei criteri microbiologici atti allo scopo.Secondo questi regolamenti un criterio microbiologico definisce l’accettabilità di un prodotto,di una partita di prodotti alimentari o di un processo produttivo,in base all’assenza,alla presenza o al numero di microrganismi e/o in base alla quantità delle rfelative tossine/metaboliti,per unità di massa,volume,area o partita.Un criterio microbiologico indica che un determinato microrganismo o gruppo di microrganismi,o tossina microbica deve essere assente,o presente al massimo in un determinato numero di unità campionarie o presente a un livello non superiore a un limite prefissato in una quantità di alimento o  di ingredienti.Il criterio deve inoltre indicare,1) l’identità dell’alimento o dell’ingrediente;2)il contaminante al quale si riferisce lo standard;3) l numero di unità campionarie per le verifiche:4)il metodo analitico da utilizzare;5) i limiti batteriologici considerati appropriati;6)il numero di unità in cui i limiti non possono essere superati;6) il punto della catena di produzione/trasformazione al quale si applica;7)le azioni da intraprendere quando i limiti non sono rispettati. I criteri microbiologici vengono stabilitida organizzazioni internazionali (ad esempio Joint food and Agricultural Organisation and World Health Organization,Codex Alimentarius)governi, aziende o enti (solo per le specifiche).In genere i governi si avvalgono dell’assistenza di organismi scientifiche internazionali come la International Commission for Microbiological Specification fof Foods o di agenzie nazionali.In Italia,l’Istituto Superiore di Sanità I tipi di  criteri adottati sono i seguenti: A) STANDARD.Criterio obbligatorio stabilito per legge,il mancato rispetto del quale costituisce una violazione punibile (ritiro dal commercio,revoca di autorizzazioni a produrre,procedimenti penali).Esso può contenere limiti sia per microrganismi patogeni sia per microrganismi indicatori dello stato igienico.B)LINEE GUIDA. Trattasi di criteri spesso adottati dall’industria alimentare o da agenzie governative per monitorare processi produttivi.Sono utilizzati per dimostrare l’efficienza di un processo,in particolare in corrispondenza di punri di controllo critici(CCP),e la conformita’con le buone di produzione (GMP):Possono includere microrganismi che non hanno importanza diretta per la salute umana e che possono essere  causa di alterazione o   riusvire utili o indispensabili per la produzione di un alimento (cibi fermentati ad esempio)In certi casi lelinee guida possono essere anche più restrittive dei criteri previsti per legge,dovrebbero essere impiegate per la validazione dei piani di autocontrollo,piuttosto che per il monitoraggio dei punti di controllo critici peri quali  occorre usare misure di controllo più continue.  C)SPECIFICAZIONE. E’ un criterio microbiologico obbligatorio o consigliato usato come requisito per l’acquisto di una materia prima o di un alimento pronto per il consumoLe specifiche sono formalizzate in un rapporto tra fornitore ed acquirente ed il superamento del criterio potrebbe comportare il rifiuto della partita di merce.

Criteri microbiologici

Normative comunitaria e nazionale

La Comunità Europea ha normato i controlli microbiologici per alcune tipologie con quattro regolamenti :il Reg.CE 2073/2005,il Reg CE.1441/2007;il Reg.UE 1086/2011.il Reg.UE 209/2013-I primi due regolamenti riguardano i criteri micrologici applicabili ai cibi pronti per il consumo.,e ad altri tipi di alimenti.Il Reg UE 1086/2011 modifica l’allegato II del regolamento CE  2160/2003 del Parlamento Europeo e del Consiglio e l’allegato I del Reg.CEE 2073/2005 della Commissione per quanto riguarda la salmonella presente nella carne fresca di pollame.Il Reg UE 209/2011 della Commissione modifica il Reg.CE 2073/2005 per quanto riguarda i criteri microbiologici applicabili ai germogli e le norme di campionamento per le carcasse di pollame la carne fresca di pollame.I criteri microbiologici  dei regolamenti consentono di individuare i germi indicatori di sicurezza alimentare e quelli indicatori di igiene.Nel primo gruppo si comprendono Listeria  monocytogenes,Salmonella spp.,Salmonella typhimurium,Salmonella enteritidis,Cronobacter sakazaki.E coli nei molluschi,E coli produttori di tossine STEC 0 157,026,0 111.010,0145 e  0104:114,enterltossina stafilococcica,istamina. Ovviamente in molti casi è necessario garantire la salubrità degli alimento provvedendo alla determinazione di altri batteri patogeni e loro tossine come certi clostridi produttori di biotossine botuliniche, Campylobacter termofili,Yersinia enterocolitica patogena,Vibrio colera spp,potenzialmente patogeni.Shigella patogene.Per gli  alimenti da cosumarsi dopo cottura destinati al consumo in territorio nazionale si deve determinare il numero di L.monocytogenes con il metodo MPN secondo l’O.M.. citata .Possibilità questa come ila determinazione dei patogeni non considerate nei due regolamenti CE in base all’accordo Stato Regioni del 10 maggio 2007. Nel secondo gruppo i germi  indicatori di igiene sono determinati con la conta dei mesofili aerobi,delle Enterobacteriaceae,di Escherichia coli non patogeni,di stafilococchi coagulasi positivi,di anaerobi solfitoriduttor,delle Pseudomonadaceae , dei batteri lattici ei di lieviti e muffe.Tutti questi microrganismi sono determinati mediante l’uso di terreni approvati da norme ISO e Afnor,ma lo possono essere anche utilizzando altri terreni di coltura descritti nella letteratura scientifica specifica spesso più efficaci  nel contare ed individuare ni microrganismi dei terreni normati. Un aspetto particolare della microbiologia alimentare è rappresentato da muffe e lieviti.Questi due gruppi di microrganismi sono mondi diversi dalla batteriologia e necessitano l’attenzione di microbiologi specialisti dei due settori. Lieviti e muffe negli alimemti possomo essere considerate come:indici di contaminazione ambientale;come  alteranti,come patogeni,come responsabili della produzione di alimenti per l’essere umano ed animale,Inoltre  alcune specie di muffe sono conosciute produttrici di micotossine per cui,per certi alimenti di origine vegetale ed anche animale (latte) è necessario valutare la presenza di micotossine. In proposito si ritiene utile fornire alcune informazione  riportate di seguito. di seguito.

Lieviti e muffe negli alimenti.

In questa sede si prendono in considerazioni i miceti citati solo come indici di contaminazione degli alimenti.Lieviti e muffe possono riuscire molto efficaci nel provocare alterazione causando problemi gravi per i produttori.Esistono parecchi fattori favorenti la colonizzazione di questi microrganismi in numerosi alimenti:1)Alcune specie possono crescere in substrati con ampio intervallo di valori di pH,rendendo così possibili la sopravvivenza e il loro sviluppo in alimenti acidi quali succhi di frutta e polpe.2)Alcune possono crescere a temperature estreme:L’intervallo di crescita dei lieviti è compreso tra 0°C e  47°C.Molte specie crescono a basse temperature e a bassi pH  costituendo così un problema ai produttori di latte fermentati.3)Molte specie sono xerotolleranti (capaci di crescere in substrati con bassa attività,come 0,65), quindi  su frutta secca,noci,grani e spezie .Altre specie osmofile ed alofile possono crescere in substrati con elevate pressioni osmotiche dovute alla presenza di zuccheri o di sale,rispettivamente.uesti microrganismi possono determinare problemi particolari Questi microrganismi possono rapprentare problemi per i produttori di alimenti da forno

Causando difficoltà e danni ai produttori di alimenti da forno e di carne essiccate /salate.4)Certe specie possono sopravvivere ai trattamenti  impiegati per abbattere la contaminazione batterica.Per esempio,alcuni produttori usano l’irradiazione,l’elevata pressione idrostatica (HP) e il trattamento con acidi organici per  uccidere i batteri e,distruggendoli o riducendo la competizione alla crescita offerta dai batteri inattivati,permettono a lieviti e muffe,sopravvissuti a questi trattamenti di crescere più liberamente.Spesso la proliferazione di muffe e di lieviti è nettamente visibile perché formano placche ben visibili delle muffe o  evidenziano  una netta modificazione del colore e dell’aspetto superficiale dell’alimento costringendo alla distruzione degli alimenti colpiti.In altri casi l’alterzione è resa manifesta dalla produzione di gas e di odori  eapori anomali avvertibili all’odorato e all’assaggio.Tutti questi tipi di alterazione nuociono economicamente al produttore o provocare lì intervento degli addetti ufficiali al controllo degli alimenti.Per evitare tali disastrose conseguenze e per assicurare la qualità commerciali ed  igienico sanitarie dei loro alimenti i produttori devono dedicare parte del loro tempo e del loro denaro per assicurarle.Lieviti ,muffe e loro spore devono quindi essere assenti o presenti entro limiti accettabili prima di lasciare i luoghi di produzione e devono mantenersi entro limiti ben precisi.I produttori devono quindi sottoporre ad analisi adeguate le materie prime e i prodotti finali sia per  monitorare i livelli di contaminazione ,sia per stabilire la esatta vita commerciale dei loo prodotti

Origine di lieviti e di muffe e loro spore

Molti lieviti e muffe sono presenti naturalmente negli ambienti di  produzione degli alimenti.La contaminazione può verificarsi durante le fasi lavorative,il confezionamento e la conservazione sia della materia prima che dei prodotti pronti per il consumo. Per il produttore è quindi importante eliminare le vie di contaminazione  riducendo al minimo possibile il rischio che essa avvenga.Le fonti principali  di contaminazione sono:1)L’aria ambientale.Lieviti e spore di muffe possono essere liberate  nell’aria da suolo,polveri,canali di scolo,superfici,materiali vari e correnti aeree. E’ necessaria la presenta di filtri alle bocche d’aria,2)Nell’acqua i liviti non sono normalmente presenti ma è anche consigliabile controllare anche questa fonte.)3)Le materie prime è preferibile provengano da fonti e fornitori attendibili e comunque devono venire monitorate valutando la possibile presenza di lieviti e di spore fungine.Particolari provvedimente devono adottare i produttori di alimenti lattiero-caseari e di prodotti da forno per i qali si impiegano glasse,marmellate,frutte secche,pasta di noci e di mandorle o marzapane.4)Per assicurare l’igienicità delle attrezzature,è indispensabile effettuare sanificazioni veramente efficaci prestando particolari interventi sanificanti nei punti più difficili da trattare come giunti,gomiti, valvole,uggelli.scanalature e simili.Nelle linee di produzione di prodotti da forno sono numerosi i residui di zuccheri sia sparsi che raggrumati e si deve provvedere alla loro eliminazione completa.5)Altre contaminazioni possono verificarsi anche durante il confezionamento.Gli involucri cartacei o di cartone (soprattutto questi) possono contenere un elevato numero di liviti e di spore di muffe che vi aderiscono per attrazione elettrostatica o per semplice deposito correntizio.La contaminazione degli imballaggi da confezionamento è una evenienza nota e la decontaminazione degliimbalaggi si ottiene mediante trattamenti termici (calore),raggi UV , perossido di idrogeno e trattamento con raggi gamma.Per conoscere le specie di lieviti e muffe  contaminanti gli alimenti  o presnti negli ambienti di preparazione di alimenti si presentano le tabelle 1 e n.2

Tabella n 1 Lieviti contaminanti ed alteranti isolati da limenti e bevande.

CONTAMINANTI PIU’ FREQUENTI (Deak e Beuchat,1996) Saccharomyces cerevisiae,Debaryomyces hansenii,Pichia anomala,Pichia membranifaciens,Rhodotorula glutinis,Rhodotorula mucilaginosa,Torulaspora delbrueckii,Kluvyeromyces marxianus,Issatchenkia orientalis,Zygosaccharomyces baili Candida parapsilosis.Zigosaccharomyces rouxii,Candida guilliermondii,Candida albidus,Candida tropicalis,Saccharomyces exiguus,Pichia fermentans,Trichosporon pullulans,Hanseniapora uva rum,Candida zeylanoides.

SPECIE ALTERANTI (Pitt eHaking,1985)Brettanomyces intermedia,Candida holmii,Candida krusei,Debaryomyces hansenii,Kloeckera apiculata,Pichia membranofaciens,Saccharomyces cerevisiae,Schisosaccharomyces pombe,Zygosaccharomyces bailii,Zygosaccharomyces bisporus,Zygosaccharomyces rouxii.

SPECIE ADDIZIONALI ALTERANTI (Tudor e Board,1993) Candida dattila;Candida globosa,Candida umicola,Candida lactis condensis,Candida lipolytica,Candida parapsilopsis,Candida sakè,Candida versatilis,Candida zeyalanoides,Cryptococcus spp.,Hansenula anomalaHansenula subpelliculosa,Kluyveromyces marxianus,Pichia burtonti,Pichia fermentans,Sporobolomyce4s roseus,Torulaspora delbrueckii,Trichosporum cutaneum,Trychosporum pullulans.

Tabella n.2 muffe presenti in bioaerosol ambientali e prodotti contaminanti e miceti alteranti.

Substrato  ARACHIDI :Aspergillus,Penicillium,Eurotium,Emericella,Trichotecium,Paecilomyces,Fusarium.

CEREALI: Durante la coltivazione.Alternaria,Chaetomium,Cladosporium,Epicoccum,Fusarium,Helminthosporurium,Trichoderma

CEREALI IN SILO:Aspergillus,Eurotium,Penicillium,Absidia,Mucor ,Rhizopus.

CEREALI:FARINE E DERIVATI;spergillus,Absidia,Alternaria,ladosporium,Fusarium,Trichothecium,Mucor,Scopulariopsis,Wallemia

FRUTTA e VEGETALI:Penicillium.Phomoppsis,Diplodia,,Botrytis,Geotricdhum,Monilia,Trichotecium,Fusarium,Alternaria,Aspergillus,

Paecilomyces.

UOVA:Penicillium,Aspergillus,Cladosporium,Mucor.

,FORMAGGIO:Mucor,Penicillium,Cladosporion,Scopulariopsis,Epicoccum,Trichoderma,Alternaria,BotrytisTrichotecium.

BURRO E MARGARINE:Alternaria,Aspergillus,Eurotium.Moniliella,Phalophora,Phoma,Penicillium.

CARNI E PRODOTTI DERIVATI:Aspergillus,Chrysonilia,Geotrichum,Cladosporium,Geomyces,Penicillium.

MUFFE ALTERANTI I VEGETALI:Alternaria,Aspergillus,Botriodyplodia,Botritys,Cladosporium,Colletotrichum,Diplodia,Fusarium,Geotrichum,

Gloeosporium,Monilinia,Mucor,Nigrospora,,Penicillium,Phomopsis,Phytophthora,Rhizopus,Trichoderma.

Numerazione di lieviti, muffe e loro spore negli alimenti

I produttori di alimenti possono ottenere indicazioni dei livelli di lieviti e muffe nei loro prodotti e sapere se siano stati  le cause premature di alterazione contando il numero di microrganismi vitali (o colonie formanti colonie  o ufc) in campioni dei prodotti.Tali quantificazioni possono essere ottenute con le metodiche qui riportate

Metodiche basate sull’uso di terreni colturali.

Tradizionalmente,le procedure di numerazione di lieviti e muffe utilizzano terdeni colturali.La scelta del terreno di crescita può dipendere dal  tipo di alimento esaminato,perché potrebbe influenzare la crescita della specie fungina ricercata. I terreni usati più comunemente includono:

POTATO DEXTROSE AGAR (POA) O AGAR PATATA,Il terreno è particolarmente adatto per l’esame dei prodotti lattiero caseari,le carni fresche i  prodotti derivati di salumeriae per contare le spore di muffe sopravviventi ai trattamenti termici applicati a prodotti a base di frutta (succhi.bibite,polpe).

OXYTETRACICLINA –GLUCOSE-YEAST EXTRACT AGAR (OGYEA)basato su una formula descritta da Mossel e coll.(1970) Questo terreno impedisce la crescita batterica (inclusi i lattobacilli a pH neutro,facilitando la crescita di lieviti e di muffe presnti in vari tipi di alimenti.Tuttavia,alimenti con elevato contenuto proteico ed elevate temperature di incubazione (circa 35°C)potrebbero inattivare l’ossitetraciclina,

ROSE- BENGALACHLORAMPHENICOL AGAR (RBCA):Questo terreno è raccomandato per l’analisi di alimenti freschi altamente proteici co0n una popolazione batterica costituita prevalentemente da  Grtam negativi.Il cloramfenicolo è un antibiotico molto stabile resistente a temperature elevate di incubazione e il colorante Rosa-Bengala colora le colonie di interesse e controlla le dimensioni e la diffusibilità delle colonie delle muffe.Lo sviluppo delle specie con crescita lenta è impedita rendendo così più facile ed accurato il conteggio delle colonie.

DICHLORAN ROSE BENGAL CHLORAMPHENICOL MEDIUM /DRBC) (Questo terreno descritto da King& Coll./1992) È una modifica dl RBCM riuscendo più inibente la crescita dei batteri e vriduce la diffusione di  muffe altamente invasive come Rhizopus e Mucor spp.

DICLORAN-GLICEROL AGAR (DG18).Descritto da Hocking e Pitt(1980) Questo terreno è raccomandato per il conteggio  delle muffe xerotolleranti presenti in  substrati secchi/semisecchi come come frutta secca,spezie,confetture,cereali,noci e prodotti essiccati a base di carne o di pesce.

ASPERGILLUS  FLAVUS PARASITITICUS AGAR (AFPA):Descritto da Pitt & Coll. Questo terrenoè utilizzato per la rapide determinazione di Aspergillus flavus e di Aspergillus parasiticus produttori di ocra tossina.Le loro colonie si svluppo con nuna colorazione color giallo arancio intenso sul reverse delle colonie rendendole nettamente visibili.

Nota. Nei certificati ufficili si usa il terreno indicato dalla norma ISO 21527-1:8 per la conta di lieviti su prodotti con attivita’ dell’acqua > 0,85 e > 0,95.

Bibliografia

Deak T & Beuchat L.R. (19996)Handbook of Food Spoilage Yeasts,CRC Press Boca Raton USA.

King A.D.;Hocking A.D.&  Pitt.J.I.(1992) Appl.Env.Microbiol,37, 959-964

Mossel D.A.A.;Klein-Semmeling H.M. & Vincentie H.M.(1970) J:Appl.Bacteriol. 33,454-457.

Pitt J.I. & Hocking A.D.(1980) J.Appl,Env. Microbiology. 39,488-492

Pitt. J.I. & Hocking A.D. (1983) J.Appl. Bact. 54, 109-114.

Pitt J.I &Hocking A:D (1985 Fungi e and Food Spoilage.Academic Press,Sidney,Australia,

Tudor  E A.& Board  R.G. (1993) Food spoilage yeast 2 ed.In :Rose A.H. &Harrison G.S (eds) The Yeasts,,vol.5 Academic Press.Londra npp.435-516

Summary

Microbial criteria for  safety of foods

In this text the microbial criteria to assury hygienic and sanitary properties of food have been reported.Yests and molds play a central role in the spoilage of foods and beverages,mainly those with high acidity and reduced  water activity.Some species are capable of spoling foods produced according to good manufacturing practices (GMPs) A descritpion of  yeasts and moulds origins and the  enumeration of  species and media,which are useful for their isolation and   counts have been reported in detail.

Riassunto

Nel testo sono riportati I criteri microbiologici adottati per garantire la salubrità degli alimenti e bevande. Lieviti e muffe  hanno un ruoòo principale nell’alterazione di  alimenti e bevande, specialmente in quelli con acidità elevate e con ridotta Aw Sono indicate le fonti di origine, le specie  isolate da ambientiedcalimentied u terreni di coltura necessari per il loro isolamento e conteggio.